弱仔猪体质差，胃肠黏膜等免疫器官发育较差[1]，肠道消化吸收能力较差，肠道菌群失调[2]，机体免疫力差，更易感染疾病，从而使弱仔猪的生长发育受阻。芽孢杆菌具极强的抗逆性，可耐受原料中的无机盐、酸化剂以及饲料加工过程中的挤压、高温、干燥，还能够耐受动物胃肠液等因素的杀灭作用[3]。在动物日粮添加中芽孢杆菌可消耗机体肠道内的大量氧气，为肠道创造厌氧条件，抑制有害细菌滋生，增加益生菌繁殖，从而维持肠道的微生态平衡[4]，是在动物生产中应用较为广泛的益生菌之一[5]。本课题组前期研究发现，采用芽孢杆菌制剂可以有效提高苏姜猪保育仔猪的生长性能[6]。本试验在保育弱仔猪日粮中添加芽孢杆菌制剂，研究其对弱仔猪生长性能、免疫性能、粪便菌群的影响，为改善苏姜猪弱仔猪生长性能，提高生产效率提供参考。1材料与方法1.1试验菌剂和动物益生菌由泰州绿圣元有限公司提供，属于统福菌复合饲用微生物制剂，含有短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等，总活芽孢数为1.0×1010 CFU/g。试验仔猪由江苏苏姜种猪有限公司提供，养殖过程中将28日龄断奶体重低于5 kg的仔猪判断为弱仔猪。1.2试验设计选取42头弱仔猪，随机分为2组，每组7个重复，每个重复3头仔猪，分栏饲养，1个重复一栏，饲养条件一致。对照组仔猪饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加1 kg/t芽孢杆菌制剂，益生菌添加量根据前期试验确定[6]。基础日粮为嘉吉饲料有限公司提供的全价保育料，原料组成：豆粕、小麦及其加工产品、矿物质元素及络合物、防腐剂、抗氧化剂、维生素及类维生素等；营养水平：水分≤13.5%、粗蛋白≥12.5%、粗纤维≤10.0%、粗灰分≤9.0%、钙0.40%~0.80%、磷≥0.25%、赖氨酸≥0.70%。试验期35 d。试验仔猪自由采食。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验第1 d与最后1 d，各重复仔猪空腹称重，记录仔猪的初重与末重。每天记录每头仔猪的投料量和余料量，每周以组为单位结料1次；若有死亡仔猪及时淘汰，并进行仔猪的称重和日粮的结算，计算仔猪的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）及料重比(F/G)。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=全期采食量/饲喂天数(2)料重比=全期耗料量/全期总增重(3)1.3.2腹泻率测定试验期每天8：00观察仔猪的肛门和粪便以判定粪便情况，对粪便进行评分。呈条形或粒状的粪便评定为0分，可以成形的粪便或呈软粪评定为1分，不能成形或粪水未呈现分离的状态评定为2分，呈液体状、不能成形或粪水呈现分离状态的粪便评定为3分[7]。粪便评分≥2分时评定仔猪发生腹泻，计算各组仔猪的腹泻率。腹泻率=腹泻头数/(每组头数×试验天数)×100%(4)1.3.3粪便微生物总DNA提取、目的基因扩增及文库构建试验最后1 d，每组每个重复随机采集1份粪便样品，冷冻，样本DNA使用TIANGEN公司磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒（DP712）进行DNA提取，检验合格后进行细菌16S rRNA 基因V3~V4区PCR扩增。扩增引物为806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′和338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′。PCR反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27个循环，72 ℃ 10 min，10 ℃保存。PCR产物经过纯化定量分析后使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建库。利用Miseq PE300（Illumina公司）平台测序。1.3.4基因序列分析不同样本序列的拆分使用QIIME2 demux插件。对拆分后的序列进行质控，修剪，去噪，拼接，去除嵌合体使用QIIME2 dada2插件，得到的特征序列表格。代表序列比对使用QIIME2 feature-classifier插件，13_8版本99%相似度的GREENGENES数据库，设置比对阈值为70%，将数据库修剪到V3V4的区域，得到了物种的分类信息表，利用ANOVA、LEfSe等方法鉴定分组和样本间丰度有差异的细菌。Alpha多样性指数、Beta多样性指数，使用QIIME2 core-diversity插件计算。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 26.0软件进行t检验和卡方检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1芽孢杆菌制剂对弱仔猪生长性能影响（见表1）由表1可知，芽孢杆菌制剂组仔猪的平均日增重、末重均极显著高于对照组（P0.01)，芽孢杆菌制剂组仔猪的平均日采食量显著高于对照组（P0.05)，芽孢杆菌制剂组仔猪的料重比显著低于对照组（P0.05)，芽孢杆菌制剂组仔猪的腹泻率和死亡率极显著低于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.T001表1芽孢杆菌制剂对弱仔猪生长性能的影响组别初重/(kg/头)末重/(kg/头)平均日增重/[g/(头·d)]平均日采食量/[g/(头·d)]料重比腹泻率/%死亡率/%芽孢杆菌制剂组4.57±0.3215.69±0.60A320.34±23.01A371.93±56.76a1.19±0.25b2.65±0.34B4.76±1.35B对照组4.58±0.3012.94±0.80B243.25±34.62B340.31±60.03b1.54±0.48a14.41±4.72A28.57±5.38A注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。研究表明，芽孢杆菌制剂可降低仔猪料重比、腹泻率和死亡率，提高饲料利用率。2.2粪便Alpha多样性检验分析结果（见表2）由表2可知，芽孢杆菌制剂组的仔猪粪便生物多样性指数极显著高于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.T002表2粪便Alpha多样性检验分析结果组别Chao1指数Observed_otus指数Shannon指数Simpson指数芽孢杆菌制剂组478.63±60.05A478.42±60.21A7.56±0.24A0.98±0.00A对照组378.14±77.02B378.14±77.02B6.49±0.44B0.95±0.02B研究表明，芽孢杆菌制剂组的仔猪粪便菌群样本中实际测定得到的OTU数量、物种丰富度极显著高于对照组。2.3仔猪粪便样品菌群beta多样性分析结果（见图1~图4）不同样品间微生物群落结构的差异采用Bray Curtis、Unweighted Unifrac和Weighted Unifrac距离进行评价，物种多样性的差异越小，相异系数也越小。Beta多样性指数热图见图1。由图1可知，图中使用不同颜色代表样品间的相异系数，两组仔猪粪便样本微生物菌群结构在物种多样性方面存在较明显差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F001图1仔猪粪便样品菌群Beta多样性分析结果注：1.各方块由上到下数值分别为Bray Curtis值、Weighted Unifrac值、Unweighted Unifrac值。2.Bacillus 01~07为芽孢杆菌组样品1号~7号，control 01~07为对照组样品1号~7号；图3与此同。β多样性PCoA分析和NMDS分析见图2和图3，图中点的距离越接近，表示样品的物种组成结构越相似。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F002图2样品菌群基于weighted unifrac距离PCoA分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F003图3样品菌群NMDS分析由图2、图3可知，芽孢杆菌制剂组仔猪的粪便菌群与对照组相比存在一定区别，芽孢杆菌制剂组点更加密集组内菌群结构相似度更高，而对照组点分布更加稀疏组内菌群结构差异更大，表明芽孢杆菌制剂组仔猪粪便菌群微生物区系在不断变化和建立，芽孢杆菌制剂组仔猪粪便菌群结构更加稳定。结合分组信息，使用PERMANOVA方法对两样品分组间β多样性指数差异显著性进行分析，结果见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F004图4PERMANOVA分析结果由图4可知，两组样品之间微生物构成差异极显著（P0.01），β多样性具有统计意义。2.4OTUs的Venn图分析结果（见图5）对所采集的14个粪便样本微生物进行测序，全部有效序列进行聚类/去噪，共形成有效序列824 978个，平均长度416.75 nt。基于OTU的绝对丰度及注释信息，试验所有样品共注释16个门、25个纲、40个目、62个科和146个属、201个种。Venn图可计算多个样本共有和唯一OTU的个数，直观反映样本OTU的相似性和重叠性。由图5可知，两组仔猪粪便样品共获得1 737个OTUs，其中共有OTUs 523个，芽孢杆菌制剂组特有OTUs 795个，对照组特有OTUs 419个，表明芽孢杆菌制剂组仔猪的粪便注释OTUs明显增多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F005图5共有或特有物种Venn图2.5各组仔猪粪便菌群组成分析结果（见图6~图8）由图6可知，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）是这两组的主要细菌门，其相对丰度在试验弱仔猪组及对照组粪便菌群中的比例占95%以上。与对照组相比，芽孢杆菌制剂组仔猪粪便菌群拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋体门（Spirochaetes）相对丰度增加，厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）相对丰度减少。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F006图6门水平上粪便微生物平均相对丰度由图7可知，普雷沃氏菌属（Prevotella）为芽孢杆菌制剂组仔猪主要优势属，链球菌属（Streptococcus）为对照组仔猪主要优势属。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F007图7属水平上粪便微生物平均相对丰度由图8可知，在属水平，与对照组相比，芽孢杆菌制剂组仔猪粪便微生物的普雷沃氏菌属（Prevotella）、密螺旋体属（Treponema）、未指明的拟杆菌目（Unspecified_Bacteroidales）、未指明的拟杆菌目S24-7菌属（Unspecified_S24_7）的相对丰度明显增加，未指明的毛螺菌科（Unspecified_Lachnospiraceae）、链球菌属（Streptococcus）、未指明的梭菌目（Unspecified_Clostridiales）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、劳特氏菌属（Blautia）相对丰度明显减少。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F008图8各组仔猪粪便微生物平均相对丰度前10对比2.6两组仔猪仔猪粪便菌群结构变化使用LEfSe分析，并根据微生物区系组成对样品分组进行线型判别分析（LDA），在进化分支图的不同分支上标记了不同周龄健康仔猪群间粪便微生物区系存在显著差异的物种，LEfSe分析进化分支见图9。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F009图9LEfSe分析进化分支图使用LDA评分（LDA值2）表示物种在不同组别中的差异，LDA值越大，表示差异越大，LEfSe分析LDA结果见图10。由图10可知，食用芽孢杆菌的弱仔猪粪便中特征性微生物为：拟杆菌门（Bacteroidetes）和螺旋体门（Spirochaetes），普雷沃氏菌属（Prevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）等；对照组弱仔猪粪便中特征性微生物为放线菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicu tes），链球菌属（Streptococcus）、劳特氏菌属（Blautia）等。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.006.F010图10LEfSe分析LDA柱形图（LDA2）注：LDA Score（log10）为线性回归分析值10的对数。3讨论3.1芽孢杆菌制剂对弱仔猪的生长性能的影响芽孢杆菌进入机体肠道后，可以分泌多种酶，能够有效降解体内多种蛋白质等有机物，对肠胃的消化吸收功能起到积极作用，改善弱仔猪的生长性能。龚泽修等[8]研究发现，在保育仔猪日粮中添加0.15%益生菌能够有效提高保育仔猪的生长性能。杨小军等[9]研究发现，日粮中添加枯草芽孢杆菌能够改善断奶仔猪的平均日采食量和平均日增重。本试验发现，芽孢杆菌制剂可提高弱仔猪的平均日采食量和平均日增重，降低料重比。因此，在日粮中添加芽孢杆菌可以改善弱仔猪的生长性能。3.2芽孢杆菌制剂对弱仔猪的腹泻率的影响胃肠道内微生物区系平衡遭到破坏是仔猪腹泻的主要原因[10]。芽孢杆菌可增强仔猪肠黏膜功能，降低腹泻率[11]。Michiels等[12]研究发现，枯草芽孢杆菌可有效降低仔猪肠道有害微生物数量，能够有效控制断奶仔猪腹泻率。本试验结果发现，添加芽孢杆菌制剂极显著降低了弱仔猪腹泻率。3.3芽孢杆菌制剂对粪便菌群多样性影响随着仔猪日龄增长，为适应固体食物的消化吸收，仔猪粪便菌群生物多样性增加，于断奶后趋于稳定[13]。稳定的肠道菌群能够抵抗病原微生物入侵[14]，腹泻仔猪的粪便生物多样性低于健康仔猪[15]。本课题组前期研究发现，苏姜猪弱仔猪肠道菌群多样性低于健康仔猪[2]。本研究结果发现，弱仔猪食用芽孢杆菌制剂后，粪便菌群结构发生变化，微生物区系多样性显著增加，弱仔猪的健康状况明显改善。3.4芽孢杆菌制剂对菌群组成的影响本试验中，在门水平上，拟杆菌门和厚壁菌门是两组的优势菌群，与魏晓等[16]研究结果一致。厚壁菌门和拟杆菌门积极参与宿主的碳水化合物代谢、氨基酸代谢和短链脂肪酸的生成，在能量生成和维持肠道健康中发挥重要作用。本试验中，芽孢杆菌制剂组和对照组仔猪粪便菌群中普雷沃氏菌属的相对丰度是22.3%和14.1%。普雷沃氏菌属是成年动物胃肠道的关键菌群，具有很强的黏蛋白质分解能力[17]，也是淀粉、植物多糖的降解的关键细菌[18]。普雷沃氏菌属是猪粪便微生物的主要菌群[19]。普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）的相对丰度在哺乳仔猪中仅为0.3%，在断奶仔猪约为哺乳仔猪的50倍[20]。本研究发现，芽孢杆菌制剂组仔猪普雷沃氏菌属增加利于日粮中淀粉、糖和纤维素的消化利用。研究发现，粪便菌群普氏菌群与肠杆菌科菌群呈负相关[21]。苏姜猪健康仔猪肠道普氏菌属丰度高于弱仔猪[2]。链球菌属（Streptococcus）是条件致病菌，对猪病具有诱导作用[22]。乳酸菌通过调节动物肠道菌群平衡，抑制病原微生物的生长，改善胃肠功能，提高食物消化率，提高机体免疫力[23]。研究发现，粪便中链球菌的相对丰度与乳酸菌相对丰度呈显著负相关[24]。拟杆菌属S24-7与炎症状态呈负相关[25]，布劳特氏菌属（Blautia）肠道中介导抗炎作用[26]。本研究发现，芽孢杆菌制剂组的仔猪粪便链球菌丰度较低，乳酸菌丰度较高，可能是芽孢杆菌和乳酸菌对链球菌具有一定的抑制作用。4结论本试验条件下，添加芽孢杆菌制剂能够提高试验猪的生长性能，增加弱仔猪的抗病力，降低弱仔猪腹泻率和死亡率；增加肠道菌群的多样性，增加了普雷沃氏菌、乳酸菌等有益菌的丰度。