2018年海尾湾夏季航次硅藻密度占总密度的98.39%，硅藻为各个海湾的主要优势类群。硅藻门中角毛藻属在海尾湾、三亚湾海域的优势度明显，为两个海域的第一优势种属，其他海域角毛藻密度也较高，是自然水体中较有优势的硅藻种类[1-5]。牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）属硅藻门中心纲（Centricae），盒形藻目（Biddulphiales），角毛藻科（Chaetocercerosceae），角毛藻属（Chaetoceros），富含软骨藻酸、氨基酸、二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）等活性物质，具有繁殖快、耐高温、营养丰富等特点，作为水产养殖中常见的优质饵料广泛应用于虾蟹贝等育苗过程[6]。牟氏角毛藻不仅是优质饵料，还能够通过光合作用将养殖尾水中的含氮化合物和磷酸盐等小分子营养物合成藻细胞的氨基酸、蛋白质、磷脂等有机化合物，有效改善养殖水质，释放水生生物生长所需的氧气。黄翔鹄等[7]研究发现，在凡纳滨对虾育苗水体中接入不同浓度的牟氏角毛藻可提高幼虾的成活率，降低水体中NH4+-N、NO2--N、化学需氧量（COD）浓度，改善虾池水质。在水体中，藻细胞周围形成一个特殊的藻际微环境，其分泌的一些物质会吸引一些特殊的微生物在该环境中生长繁殖，形成独特的藻际微生物群落。自藻菌共生体系概念提出后，国内外在利用藻菌共生体系处理废水方面取得大量研究成果，衍生出多种藻菌共生体系的水处理工艺。小球藻在光照下与活性污泥共培养，在1 d内对COD、NH4+-N、TP的去除率可达87.3%、99.2%和83.9%[8]。与采用单一的硝化细菌或单独微藻相比，由硝化细菌和链带藻（Desmodesmus sp.）组成的共生系统对生猪养殖废水中氨氮、总氮和总磷的去除率均最高，微藻生物量最大[9]。使用曲霉（Aspergillus sp.）为生物质载体实现小球藻（Chlorella vulgaris）的固定化，成功构建菌藻共生体，实现微藻的高效收获，将此共生体系应用于市政污水和畜禽废水处理能够有效降低废水氨氮、总氮（TN）、总磷（TP）和COD含量[10]。构建互惠互利的藻菌共生体系，使体系中的双方彼此促进，进而实现废水的资源化处理是目前的研究热点之一。目前，关于牟氏角毛藻与藻际细菌相关的研究较少。本研究以热带海水中筛选的牟氏角毛藻为材料，分离其藻际细菌，探究不同藻际细菌对牟氏角毛藻生长和代谢产物积累的影响，为牟氏角毛藻构建藻菌共生体系、促进其在水产养殖中产品开发和应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料牟氏角毛藻的藻株分离自海南岛海域，并经本实验室纯化鉴定，使用f/2培养基平板保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带微藻资源研究组。1.2牟氏角毛藻藻际细菌的分离鉴定1.2.1牟氏角毛藻藻际细菌的分离准备2216E培养基固体平板，取生长至对数期的牟氏角毛藻藻液，采用无菌液体培养基或无菌海水稀释至10-5倍数。采用平板涂布法将藻液涂布于2216E固体培养基中，平板用封口膜封好，置于智能培养箱中30 ℃培养7~10 d。待菌落颜色大小不再变化，根据菌落的不同形态特征挑选单菌落，单菌落重复用平板划线2~3次，至平板上菌落大小形态一致。1.2.2藻际细菌的16S rDNA鉴定挑取纯化的单菌落至20 μL无菌水中作为扩增模板，使用16S rDNA通用引物进行扩增。PCR扩增反应体系（25 μL）：2×F8 FastLong PCR Master MIX 12.5 μL、引物27F 1 μL、1492R 1 μL、模板1 μL、无菌超纯水9.5 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃温育5 min。PCR产物使用含Goldview的1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压120 V，时间20~30 min。选取大小约1 500 bp的PCR产物送样至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；将测序得到的菌株16S rDNA序列在GenBank中进行BLAST比对，若有相似度高的序列信息则进行下载，使用MEGA6.0软件构建系统发育树，获得3株藻际细菌M1、M2、M3用于后续试验。1.3测定指标及方法1.3.1牟氏角毛藻生物量测定以菌株M1、M2、M3和牟氏角毛藻单独培养（CM）为对照，牟氏角毛藻与不同菌株共同培养（M1+CM、M2+CM、M3+CM）为试验组，各藻株在智能光照培养箱中培养15 d，培养条件：光照20%（24 h），湿度50%，温度25 ℃，每天早晚手动摇藻1次。取200 μL新鲜藻液，加入96孔板中测定OD680 nm值。离心管提前使用60 ℃烘干至恒重，称离心管重为W1（mg），取150 mL藻液，8 000 r/min离心5 min，收集沉淀，60 ℃烘干至恒重，称重为W2（mg），计算藻株干重。藻株干重=(W2－W1)/150×1 000(1)1.3.2牟氏角毛藻色素含量测定取10 mL的藻液于离心管，在高速冷冻离心机中8 000 r/min离心5 min。使用超纯水反复洗涤离心2~3次，弃去上清液，将下方沉淀的藻体使用10 mL萃取液（丙酮∶乙醇=1∶1），室温避光浸提24 h，中间颠倒混合几次，直至藻粉完全失去绿色、变成灰白色为止。浸提结束，10 000 r/min离心5 min，取上清液，弃去沉淀。以混合萃取液为空白对照，在474.0（A474 nm）、642.5（A642.5 nm）和665.0 nm（A665 nm）波长下比色测定样液的吸光值，计算叶绿素、总类胡萝卜素的浓度。叶绿素a浓度=9.99A665 nm-0.086 7A642.5 nm (2)叶绿素b浓度=17.7A642.5 nm-3.04A665 nm (3)总类胡萝卜素浓度=4.92A474 nm-0.025 5[a]-0.225[b](4)式中：[a]为叶绿素a的浓度，[b]为叶绿素b的浓度。1.3.3牟氏角毛藻多糖含量1.3.3.1蒽酮-硫酸溶液的配制精密称取0.2 g蒽酮，加浓硫酸溶液（95%~98%）溶解后倒入100 mL棕色的容量瓶中，加浓硫酸溶液定容至100 mL，混匀（现配现用）。1.3.3.2葡萄糖标准溶液的配制精密称定无水葡萄糖标准品0.1 g，置于100 mL棕色的容量瓶中，加蒸馏水定容至100 mL，配成1.0 g/L葡萄糖标准品溶液，分别移取葡萄糖溶液2.5、5.0、10.0、15.0和20.0 mL，置于100 mL容量瓶中稀释至刻度，摇匀。1.3.3.3葡萄糖标准曲线分别移取葡萄糖标准品溶液1.0 mL于具塞试管中，以1.0 mL蒸馏水作空白对照，分别加入4.0 mL 2%蒽酮-硫酸溶液，置于冰水浴中摇匀，95 ℃水浴中加热15 min，在冰水浴冷却3 min；于OD630 nm处测吸光度，以多糖浓度为x轴，吸光度为y轴绘制标准曲线。1.3.3.4微藻总多糖测定取1.0 mL的新鲜藻液，步骤同葡萄糖标准曲线，根据以葡萄糖标准液制作的标准曲线计算出总多糖的相对浓度。1.3.3.5藻胞内多糖的提取与测定藻液培养10 d后取1.5 L藻液离心，收集藻细胞，冷冻干燥，获得微藻藻粉，称重，-20 ℃保存。藻胞内粗多糖提取：准确称取0.05 g的微藻冻干粉末，与1.5%的氢氧化钠溶液按料液比1∶20 mg/L充分混合，80 ℃提取3 h，8 000 r/min离心10 min，取上清液加入3倍体积的无水乙醇溶液，4 ℃静置过夜，离心取沉淀。沉淀中加入2 mL 3%三氯乙酸（TCA），充分搅拌至沉淀不再溶解，8 000 r/min离心10 min，弃上清液，重悬浮于ddH2O中，按葡萄糖标准曲线测定方法测多糖，在葡萄糖标准曲线中计算总多糖浓度。1.3.4牟氏角毛藻油脂含量测定称取干燥后的藻粉50 mg，置于离心管，加入7.5 mL氯仿-甲醇（体积比1∶2）溶液，37 ℃下振荡提取24 h，收集上层有机相；藻渣再使用7.5 mL氯仿-甲醇溶液提取一次；合并2次有机相，加入5 mL氯仿和9 mL ddH2O，使其比例为氯仿∶甲醇∶水=2∶2∶1.8；将混合液摇匀，静置1 h，分层，收集下层氯仿层，60 ℃水浴蒸去溶剂氯仿，70 ℃烘干至恒重。称量所得油脂，计算总脂含量及总脂产率。总脂含量=所得油脂重量/藻粉干重×100%(5)总脂产率=所得单位体积油脂重量/培养天数(6)1.3.5牟氏角毛藻蛋白含量0.1 mol/L的PBS配制：称8.0 g氯化钠、0.2 g氯化钾、1.44 g磷酸氢二钠，0.24 g磷酸二氢钾溶于ddH2O，使用盐酸调节pH值7.2，定容至100 mL。准确称取2 mg冷冻干燥的微藻藻粉于玻璃匀浆器，加入100 μL 0.1 mol/L PBS，充分研磨藻粉，使细胞壁完全破碎，吸出，置于2 mL EP管，使用900 μL 0.1 mol/L的PBS分3次洗涤玻璃匀浆器，吸出，置于上述EP管，5 000 r/min离心10 min，上清液按照BCA法蛋白定量试剂盒说明进行蛋白质定量分析，在562 nm波长下使用紫外分光光度计测其吸光度值，根据标准曲线换算蛋白质含量。2结果与分析2.1牟氏角毛藻藻际细菌的分离结果（见图1）由图1可知，对菌落分离划线获得3株藻际细菌，分别为M1、M2、M3。M1菌落较大，圆形，颜色为橘黄色，表面光滑，边缘有扩散现象；M2为中等大小菌落，圆形，白色，表面光滑湿润，边缘平整；M3菌落明显小于M1、M2，圆形，白色，表面光滑，边缘平整。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F001图1牟氏角毛藻藻际细菌的分离结果2.2藻际细菌16S rDNA鉴定结果（见图2、图3、表1）由图2可知，分离株使用16S rDNA引物进行扩增，得到16S rDNA片段大小约1 400 bp。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F002图2藻际细菌16S rDNA扩增产物电泳结果注：Marker为DL2000 DNA。将序列在GenBank中进行BLAST比对，下载相似度高的序列信息，进一步使用MEGA6.0软件构建系统发育树。由图3可知，M1与Muricauda lutimaris聚为1支，序列一致性为93.38%，亲缘关系相近，分类地位相同；M2与Bacillus oceanisediminis聚为1支，序列一致性为96.95%；M3与Marinobacter salsuginis聚为1支，序列一致性为97.66%，最终判定结果见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F003图3藻际细菌系统发育树10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.T001表13株菌株16S rDNA测序结果菌株序列长度/bp序列一致性/%拉学名中文名称M11 42893.38Muricauda lutimaris海泥鼠尾杆菌M21 40696.95Bacillus oceanisediminis海洋沉积芽孢杆菌M31 42397.66Marinobacter salsuginis海杆菌由表1可知，分离得到的3株菌株分属3个种属，M1为Muricauda lutimaris，M2为Bacillus oceanisediminis，M3为Marinobacter salsuginis。2.3藻际细菌对牟氏角毛藻生物量的影响（见图4）由图4可知，牟氏角毛藻加入共生菌株的OD值和干重均显著高于单独培养（P0.05），M2+CM组的OD值和干重显著高于其他组（P0.05），菌株M2对牟氏角毛藻具有明显的促生长作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F004图4藻际细菌对牟氏角毛藻生物量的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。培养15 d后，M2+CM的OD值为0.174，比对照组（M2与CM相加）增加47.0%；M2+CM的细胞干重达到0.854 g/L，比对照组（M2组和CM组相加）增加42.9%。2.4藻际细菌对牟氏角毛藻色素含量的影响（见图5）由图5可知，培养15 d后，藻菌共培试验组叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素含量均显著高于CM组（P0.05）。菌株M1、M2、M3均能够使牟氏角毛藻富集更多的色素，其中菌株M2对色素的富集量最明显，培养15 d后叶绿素a含量达到1.42 mg/L，比CM组增加66.0%；类胡萝卜素含量0.63 mg/L，比CM组增加102.6%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F005图5藻际细菌对牟氏角毛藻色素含量的影响2.5葡萄糖标准曲线及蛋白质标准曲线结果葡萄糖标准曲线见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F006图6葡萄糖标准曲线由图6可知，葡萄糖浓度与吸光度的标准曲线为：y=2.119 4x-0.005 6。根据葡萄糖标准曲线换算蛋白质浓度与吸光度标准曲线为：y=0.001 3x+0.007 8。2.6藻际细菌对牟氏角毛藻多糖含量的影响（见图7）由图7可知，M1+CM、M2+CM、M3+CM培养15 d后，总多糖含量分别达到64.1、78.5和70.4 mg/L，M2+CM产生的总多糖显著高于其他组合（P0.05），M2+CM产生的总多糖比对照组（M2组与CM组相加）提高34.9%。M2+CM、M3+CM的胞内多糖含量分别达到22.5、23.3 mg/L，M3+CM共培组合的胞内多糖含量比对照组（M3组与CM组相加）提高26.8%。图7藻际细菌对牟氏角毛藻多糖含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F7a1（a）总多糖含量 （b） 胞内多糖含量2.7藻际细菌对牟氏角毛藻油脂含量的影响（见图8）由图8可知，M1+CM、M2+CM、M3+CM共同培养后15 d后，油脂含量分别达细胞干重的17.3%、21.7%和19.8%，总产脂率分别为61.0、74.8和70.7 mg/(L·d)，菌株M2能够促进牟氏角毛藻积累更多的油脂，M2+CM共培组合的油脂含量比对照组（M2组与CM组相加）提高29.2%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F008图8藻际细菌对牟氏角毛藻油脂含量的影响2.8藻际细菌对牟氏角毛藻可溶性蛋白含量的影响（见图9）由图9可知，菌株M1、M2、M3均能够显著促进牟氏角毛藻蛋白质含量的积累，培养15 d后，M1+CM、M2+CM、M3+CM的藻细胞中蛋白质含量分别为18.6、23.5和20.4 mg/L，其中菌株M2促进效果优于其他菌株，M2+CM共培组合的蛋白质含量比对照组（M2组与CM组相加）提高23.7%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.020.F009图9藻际细菌对牟氏角毛藻蛋白含量的影响3讨论本研究从牟氏角毛藻的藻际环境中分离了3株藻际细菌，经鉴定属于3个种属。菌株M1为海泥鼠尾杆菌（Muricauda lutimaris），属于拟杆菌门黄杆菌纲黄杆菌科鼠尾菌属，为革兰氏阴性菌，好氧或兼性厌氧；菌株M2为海洋沉积芽孢杆菌（Bacillus oceanisediminis），属于厚壁菌门芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌，好氧或兼性厌氧菌株；M3为海杆菌（Marinobacter salsuginis），属于拟杆菌门海杆菌属。不同的微藻细胞释放不同的代谢产物，构成了不同的藻际环境，其中生存的细菌也各不相同。Krohn等[11]对不同微藻的藻际微生物转录组数据分析发现，小球藻和四尾栅藻的藻菌微生物中α-变形菌门细菌的基因最活跃，而在微星鼓藻的藻际微生物中拟杆菌门细菌的基因表达率最高。Guannel等[12]分析18个海洋硅藻拟菱形藻藻株共生细菌群落的组成，发现大多培养物中均含有玫瑰杆菌类群、γ-变形菌纲和黄杆菌纲的细菌。段露露等[13]从斜生栅藻中分离7株菌株，包括微球菌（Micrococcus）、假单胞菌（Pseudomonas）、微小杆菌（Exiguobacterium）和葡萄球菌（Staphylococcus sp.），与本研究从牟氏角毛藻中分离出的细菌种属存在差别。依照对共生生物体的利弊，共生体系的关系可分为6种：互利共生（+/+）、偏利共生（+/0）、偏害共生（0/-）、中立（0/0）、寄生（+/-）、互害（-/-）[14]，但在实际环境中，中立模式基本不存在，共生体系双方至少在生存空间上相互竞争。在藻菌共生体系中，细菌将有机污染物降解为氨氮、硝酸盐、磷酸盐、二氧化碳等小分子营养物，藻类吸收环境中的小分子营养物完成自身的生长需求，并在光照条件下进行光合作用释放氧气。因此，多数天然的藻菌共生体系均为互利共生型，藻菌双方通过营养交换、信号传导和基因转移等作用机制结合[15]。赵婕等[16]研究表明，从微囊藻群体分离的产碱性磷酸酶（ALP）细菌与微囊藻共培养，细菌会附着于微囊藻表面水解磷酸酯，为微囊藻提供无机磷源。Kazamia等[17]从B12依赖型雪藻（Chlamydomonas nivalis）的培养物中分离出根瘤菌（Mesorhizobium sp.），发现根瘤菌能够提供B12依赖型绿藻（Lobomonas rostrata）生长所需维生素以换取固定碳，两者可在缺乏有机碳源和维生素B12的环境中长期稳定共生。本研究中，M2菌株与牟氏角毛藻共培15 d后，与对照组相比，藻的OD680 nm值、细胞干重、叶绿素a含量及类胡萝卜素含量均显著提高，表明M2菌株对牟氏角毛藻生长及光合色素的积累具有显著的促进作用，藻菌之间存在互惠共存关系。本试验结果显示，M2菌株显著促进了牟氏角毛藻的代谢产物的积累，藻的总多糖、油脂和蛋白含量分别比对照组提高34.9%、29.2%和23.7%，其中总脂产率高达74.8 mg/(L·d)。Do Nascimento等[18]将根瘤菌与含油纤维藻（Ankistrodesmus sp.）共同培养，经优化处理后，油脂的积累能增加30%。张靖洁等[19]将埃氏小球藻（Chlorella emersonii）与菠萝泛菌（Pantoea）以1∶5的比例共培养，埃氏小球藻在第8 d生物量达5.86 g/L，藻细胞含油量为26.88%，总油脂产量为1.575 g/L，且单不饱和脂肪酸（MUFA）高达554~564 mg/L。Yen等[20]将酵母（Rhodotorula glutinis）与栅藻共培养，栅藻生物量由40%提高至50%，脂类含量则由60%提高至70%。Ban等[21]研究发现，单胞菌与莱茵衣藻共培养能够减缓叶绿素降解，促进淀粉积累，维持蛋白质含量在较高水平。段露露等[22]在杜氏盐藻中分离得到5株细菌，分属于涅斯捷连科氏菌属（Nesterenkonia）、盐单胞菌属（Halomonas）和海杆菌属（Marinobacter）等3个属，其中一株盐单胞菌与杜氏盐藻共培养15 d后，盐藻多糖、蛋白质、总脂含量分别比对照组增加了34.8%、71.2%和37.6%。上述研究结果与本研究结论一致，表明微藻中添加藻际细菌进行共培养能够促进微藻胞内油脂、蛋白等营养物质的积累，提高微藻的营养成分。该技术的进一步应用有望强化微藻营养，促进水产动物的健康生长。4结论本研究从牟氏角毛藻藻际环境中分离到3株藻际细菌，其中M2菌株海杆菌（Marinobacter salsuginis）对牟氏角毛藻生长及色素和代谢物积累促进效果最显著，可进一步应用于与牟氏角毛藻构建藻菌共生培养体系，以期建立牟氏角毛藻快速稳定的规模化人工培养技术。