巨菌草产量高，营养价值丰富，具有青绿、多汁、易消化、适口性好等特点，广泛应用于牛[1-2]、羊[3]、猪[4]、鸡[5]、鸭[6]等养殖中。巨菌草青贮可解决其季节性不平衡的问题，提高巨菌草的粗蛋白含量，降低粗纤维含量，且巨菌草青贮富含矿物质、氨基酸等活性物质[7]，饲喂效果更佳。有研究表明，利用发酵技术对巨菌草适度发酵，可消除巨菌草中的抗营养因子，将其中的大分子蛋白质降解为小分子多肽类物质[4]。发酵过程中会产生大量益生菌和乳酸，降低饲料pH值，提高饲料适口性[8]。饲喂巨菌草发酵饲料可提高肉牛增重[1]、奶牛经济效益[2]和绵羊免疫力[9]，改善香猪的生长性能[4]。巨菌草中可溶性碳水化合物含量较低，在青贮加工过程中需要适当加入酶制剂，从而促进巨菌草内的乳酸发酵，快速降低pH值，保障青贮饲料的发酵品质以及营养价值[10]。张诗等[11]研究了添加纤维素酶、木聚糖酶与绿汁发酵液及其复合添加对巨菌草青贮品质的影响，但尚未发现利用植物乳杆菌、乳双歧杆菌、凝结芽孢杆菌等单一或复合益生菌发酵优质菌草生物饲料的研究。本研究使用复合益生菌制作发酵巨菌草饲料，研究发酵巨菌草的营养成分，为开发优质的菌草生物饲料提供参考。1材料与方法1.1试验原料巨菌草由河南省周口市鑫荣草业科技有限公司川汇区试验基地提供。1.2菌种培养植物乳杆菌（1×1010 CFU/g）、乳双歧杆菌（1×1010 CFU/g）、凝结芽孢杆菌（1×1010 CFU/g）菌种均在河南中微生物科技研究院（有限合伙）制备，具体操作步骤如下。植物乳杆菌：使用接种针从植物乳杆菌平板上挑取已纯化分离的菌落接种于已灭菌的液体培养基玻璃瓶中，密封，（36±1）℃摇床100 r/min培养48 h，离心后收集菌泥、加脱脂乳粉、冷冻干燥，制成植物乳杆菌菌粉。乳双歧杆菌：同前法接种乳双歧杆菌于有液体培养基的玻璃瓶中，加盖充氮密封，置于（36±1）℃培养箱静置培养48 h，同前法制成乳双歧杆菌菌粉。凝结芽孢杆菌：同前法接种凝结芽孢杆菌于液体培养基的玻璃瓶中，加盖密封，置于（40±1）℃摇床180 r/min培养48 h，同前法（喷雾干燥）制成凝结芽孢杆菌菌粉。1.3复合益生菌的菌液制备将植物乳杆菌、乳双歧杆菌、凝结芽孢杆菌粉剂按照1∶1∶1比例（重量比）混匀，按1∶200比例溶于水，制成复合益生菌液。1.4试验设计在试验基地中选择处于3个月生长期、100~150 cm的巨菌草，将巨菌草切碎至3~5 cm，采集样本，测定巨菌草可溶性碳水化合物（WSC）含量[11]，确定其是否满足饲料发酵成功所需的最低含糖量；使用水分测定仪测得巨菌草含水量约为70.58％。利用裹包机将巨菌草裹包发酵。对照组直接装入聚乙烯塑料袋，裹包，密封；复合益生菌发酵组（3种菌含量各为108 CFU/kg）将2 mL/kg菌液均匀喷洒在巨菌草中，搅拌混匀，同前法制作裹包巨菌草青贮发酵饲料。持续发酵45 d，开袋，测定相关指标。1.5测定指标及方法1.5.1营养成分按张诗等[11]方法测定巨菌草及巨菌草青贮饲料中干物质（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、钙（Ca）、磷（P）、WSC含量。1.5.2发酵饲料品质评定1.5.2.1感官评定采用发酵饲料感官评定标准，根据色泽、气味、结构、水分、pH值对巨菌草青贮发酵进行评分[12]。感官评定标准见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.025.T001表1感官评定标准项目色泽气味结构水分pH值总分优质青绿色或黄绿色（14~20）酸香味（18~25）松软不粘手（8~10）紧压，湿润但不形成水滴（14~20）3.4~3.8（18~25）76~100良好黄褐色（8~13）酒香味（9~17）松软无黏性（4~7）紧压，可形成水滴（8~13）3.9~4.1（9~17）51~75一般褐色（1~7）刺鼻酸香（1~8）略带黏性（1~3）紧压，有水分流出（1~7）4.2~4.7（1~8）26~50低劣黑褐色（0）腐败霉烂味（0）发黏结块（0）干燥或抓握见水（0）4.8以上（0）0~251.5.2.2发酵品质称取20 g巨菌草青贮发酵饲料样品，置于500 mL锥形瓶中，加入180 mL蒸馏水，置于4 ℃冰箱24 h，每12 h摇晃一次，利用四层纱布和定性滤纸过滤，获得发酵饲料滤液。取1份5 mL滤液，利用PB-10型酸度计（赛多利斯）测定pH值；剩余滤液分3份，-20 ℃保存，分别按对文献[11]至文献[13]的方法测定滤液中乳酸、挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸）以及氨氮、总氮含量，计算乳酸/乙酸、氨氮/总氮。1.6数据统计与分析采用SPSS 20.0对试验数据进行t检验，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1巨菌草中营养成分分析（见表2）由表2可知，巨菌草中的营养成分组成与一般禾本科牧草基本相符。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.025.T002表2巨菌草营养成分分析（干物质基础）项目DMWSCCPEENDFADFCFCaP含量29.428.866.612.7472.9044.036.520.380.21%2.2复合益生菌对巨菌草发酵饲料感官评分的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，复合益生菌发酵组巨菌草发酵饲料气味评分、色泽评分、pH值评分和总评分显著提高（P0.05），而复合益生菌对巨菌草的结构评分、水分评分无影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.025.T003表3复合益生菌对巨菌草发酵饲料感官评分的影响项目气味评分色泽评分结构评分水分评分pH值评分总评分P值0.0210.0170.8130.8160.0030.006对照组20.30±0.82b15.70±0.95b8.67±0.5116.80±1.1010.60±0.85b72.07±3.66b复合益生菌发酵组23.07±1.01a18.70±0.90a8.79±0.6216.60±0.8516.47±1.36a83.62±0.78a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3复合益生菌对巨菌草发酵饲料营养成分的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，复合益生菌发酵组巨菌草发酵饲料中CP和WSC含量显著提高（P0.05），NDF和ADF含量显著降低（P0.05），其他各项指标差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.025.T004表4复合益生菌对巨菌草发酵饲料营养成分的影响（干物质基础）项目DMCPEENDFADFWSCCaPP值0.2180.0480.7980.0290.0240.0460.6610.184对照组27.08±0.395.92±0.19b2.39±0.1770.39±0.40a45.82±0.57a1.84±0.10b0.34±0.040.18±0.02复合益生菌发酵组27.42±0.126.27±0.10a2.42±0.0868.28±0.72b44.20±0.55b2.24±0.22a0.36±0.060.20±0.02%2.4复合益生菌对巨菌草发酵饲料发酵品质的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，复合益生菌发酵组巨菌草发酵饲料中乳酸、乙酸、丙酸、总氮含量显著提高（P0.05），pH值、丁酸和氨态氮含量以及氨态氮/总氮显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.025.T005表5复合益生菌对巨菌草发酵饲料发酵品质的影响项目pH值乳酸/%乙酸/%丙酸/%丁酸/%乳酸/乙酸氨态氮/(mg/100 g)总氮/(mg/100 g)氨态氮/总氮/%P值0.0430.0150.0190.0230.0270.1620.0290.0470.033对照组4.49±0.33a0.81±0.14b0.55±0.10b0.13±0.05b0.13±0.03a1.48±0.0382.59±3.68a947.67±30.62b8.74±0.62a复合益生菌发酵组3.89±0.13b1.43±0.23a0.86±0.13a0.35±0.08a0.07±0.02b1.67±0.2069.26±5.84b1 002.70±30.25a6.92±0.77b3讨论适宜的含水率、含糖量和厌氧环境是保证发酵成功的条件。饲料原料含水率在65％~75％[14]时，较宜调制发酵饲料。本研究中，巨菌草含水率为70.58%，与张诗等[11]发酵条件相似，处于适宜发酵的水分含量范围。乳酸菌大量繁殖需要一定的发酵底物。原料中足够的WSC含量是保证饲料发酵品质的关键条件。WSC含量高于10%时（干物质基础）[14]，能够较好地满足乳酸发酵。本研究选用的巨菌草中WSC含量为8.86%，略低于较好满足乳酸发酵的水平。因此，需要添加有益于促进乳酸菌发酵的益生菌，改善巨菌草发酵饲料的品质。3.1复合益生菌对巨菌草发酵饲料感官评分的影响优质发酵饲料气味芳香，且接近原料颜色，一般呈绿色或黄绿色，质地柔软湿润、松散，不粘手。本研究中，两个处理组巨菌草发酵饲料整体均呈黄绿色、有光泽、有酸香味，茎叶结构良好、脉络清晰，质地湿润、紧凑，捏团后逐渐散开。但发酵组饲料酸香味更浓、色泽更接近巨菌草原料本色，导致其感官评分指标（气味评分、色泽评分、pH值评分和总评分）显著高于对照组。结果表明，添加复合益生菌改善了巨菌草发酵饲料感官评分。可能与复合益生菌中多种微生物加速饲料的乳酸发酵和pH值降低有关[15]。3.2复合益生菌对巨菌草发酵饲料营养成分的影响DM、CP、NDF、ADF等是评价发酵饲料营养价值的主要指标。研究发现，添加乳酸菌可提高羊草[16]、王草[17]以及柑橘肉与小麦壳混合[18]发酵饲料的CP含量，但不影响DM、NDF和ADF含量。但也有研究表明，添加乳酸菌可提高苜蓿、羊草和交狼尾草青贮料等的CP含量，降低NDF和ADF含量，提高青贮发酵品质[19]。本研究发现，利用复合益生菌发酵巨菌草显著提高了巨菌草发酵饲料CP和WSC含量，降低了NDF和ADF含量，与上述研究结果基本一致。原因可能是复合益生菌中多种微生物的增殖，增加了发酵饲料的菌体蛋白含量，降低了蛋白质损失[20]；有效降解了植物细胞壁，改变了纤维结构，将原料中的结构性多糖降解为葡萄糖，以释放WSC供乳酸发酵，从而改善青贮饲料的发酵品质和饲用价值[14]。3.3复合益生菌对巨菌草发酵饲料发酵品质的影响pH值是衡量发酵饲料品质的重要指标。良好发酵饲料的pH值低于4.2[21]，否则有可能出现饲料腐败。本试验中，虽然两组发酵饲料均未出现腐败，但复合益生菌发酵组的巨菌草发酵饲料pH值（3.89）低于4.2，且显著低于对照组（4.49），使复合益生菌发酵组的巨菌草发酵饲料感官评分和发酵品质明显优于对照组。研究表明，植物乳杆菌、乳双歧杆菌等在发酵过程中会产生大量有机酸，特别是乳酸[22]；而凝结芽孢杆菌也会产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸[23]，从而降低pH值。挥发性脂肪酸含量及其构成能够反映青贮饲料发酵状况，其中乳酸含量越高，丁酸含量越低，青贮饲料发酵状况越好[24]。本研究添加复合益生菌发酵使巨菌草发酵饲料中植物乳杆菌、乳双歧杆菌、凝结芽孢杆菌等迅速成为优势菌群，产生大量有机酸，特别是乳酸（52.77%），降低了pH值，从而保证发酵饲料品质，减少了营养成分损失。与添加乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌等能够显著提高燕麦[25]、水稻秸秆[26]、苜蓿[27]、玉米秸秆[28]等发酵饲料中有机酸的含量，特别是乳酸含量，降低pH值，改善饲料的发酵品质的结果一致。氨态氮含量可反映腐败微生物分解蛋白的程度，而丁酸含量是反映饲料腐败程度的关键因素，二者含量越高表示发酵饲料品质越差。本试验中，复合益生菌发酵组总氮含量显著增加，氨态氮、丁酸含量和氨态氮/总氮值显著降低，主要与复合益生菌发酵组pH值较低有关。研究表明，随着发酵饲料pH值降低（4.2以下），可有效抑制丁酸菌和其他有害微生物活性，减少蛋白质分解和丁酸发酵[29]，从而改善发酵饲料品质。因此，在巨菌草发酵饲料中添加植物乳杆菌、乳双歧杆菌和凝结芽孢杆菌等复合益生菌可以改善其发酵品质。4结论本研究结果表明，在巨菌草发酵饲料调制中，添加复合益生菌（植物乳杆菌、乳双歧杆菌和凝结芽孢杆菌的重量比为1∶1∶1）可显著提高其发酵饲料的营养价值、感官评分，改善发酵品质。