与传统饲料相比，发酵饲料具有易吸收、促生长、平衡动物肠道菌群的优势[1-3]，能够有效降低饲料中的抗营养因子[4]，满足目前水产养殖业的发展需要。研究表明，使用发酵饵料可以提高水产养殖动物的营养吸收，促进鱼体生长，提高机体免疫力，增强水产动物的体质[5]。肠道作为鱼类消化吸收场所，对维持鱼体健康具有重要作用[4,6]。目前，关于发酵水产动物饵料的研究多集中在发酵植物蛋白源方面，但关于水产发酵配合饵料方面的研究较少。鳙鱼（Aristichthys nobilis）属硬骨鱼纲鲤形目鲤科鲢亚科鳙属鱼类，俗称胖头鱼、花鲢，是我国主要淡水养殖经济鱼类之一[7]。本试验以鳙鱼为研究对象，使用微生物益生菌发酵鳙鱼配合饵料，探究不同比例发酵配合饵料对鳙鱼肠道健康的影响，以期为鳙鱼生物发酵饵料的研发提供参考。1材料与方法1.1试验材料鳙鱼鱼苗由湖南澧县养殖户池塘鱼苗提供。试验饵料为广东海大集团股份有限公司的渔用配合饵料。乳酸菌（保藏号：1511C0002100005335）、芽孢杆菌（保藏号：1511C0002100009606）和酵母菌（保藏号：1522C0002100005335）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。1.2发酵配合饵料配制选择芽孢杆菌、酵母菌及乳酸菌为主要发酵菌种，有效活菌数为1.10×108 CFU/g，按1∶1∶1体积比混合，将复合菌种和水按1∶20比例混匀，配合饵料和复合菌种按1∶65的比例混匀。将原料粉碎，过筛，装入发酵袋，35 ℃恒温箱进行发酵，3 d后取出。发酵袋略微胀袋，能够闻到些许酸味时，取部分样品测试pH值，样品为酸性，将饵料移出恒温箱，放入冰箱低温冷藏。1.3试验设计与饲养管理选择大小均匀的鳙鱼180尾，随机分为3组，每组3个重复，每个重复20尾鱼，F0组鱼饲喂配合饵料，F50组鱼饲喂50%配合饵料+50%发酵饵料，F100组鱼饲喂100%发酵饵料。各组饵料的营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.015.T001表1各组饵料的营养水平组别粗蛋白（CP）粗脂肪（EE）粗灰分（Ash）F0组32.96±0.658.37±0.1310.88±0.15F50组32.31±1.018.57±0.2011.21±0.20F100组32.33±0.128.46±0.0411.06±0.12%将鱼种驯养2 w，每天7：00及18：00按鱼体重3%的投饵量进行人工投喂。试验期8 w。饲养期间连续充气，水温保持25~28 ℃，pH值7.3~7.5，溶解氧含量不低于5 mg/L。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验开始和结束，对每桶鱼进行称重，记录鱼的初重（IBW）和末重（FBW），计算存活率（SR）、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）。SR=(Nt/N0)×100%(1)WGR=(Wt-W0)/W0×100%(2)SGR=(lnWt-lnW0)×100%/t (3)式中：N0为试验初始鳙鱼尾数，Nt为试验结束存活的鳙鱼尾数，W0和Wt分别为鳙鱼初重和末重（g），t为饲养天数（d）。1.4.2肠道消化酶活性饲养试验结束，鳙鱼停食24 h，进行称重和计数，每组取3尾鱼置于托盘解剖取出内脏团，分离鳙鱼中肠及中肠肠道内容物的样品，放入2 mL离心管中，-20 ℃保存。将鳙鱼肠道组织与生理盐水按照1∶9比例稀释成10%匀浆液，4 ℃、2 500 r/min条件下，使用高速研磨仪匀浆处理，离心10 min，取上清液，-20 ℃保存。鳙鱼肠道酶活性使用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。蛋白酶（PTS）（货号：A080-2）、脂肪酶（LPS）（货号：A045）、淀粉酶（AMS）（货号：C016）均使用分光光度法测定肠道酶活。肠道PTS活性：以每毫克蛋白中含有的PTS每分钟使吸光度变化0.003为一个PTS活力单位。肠道LPS活性：以1 mg蛋白的酶液每分钟催化脂肪产生1 μmol脂肪为1个LPS活力单位。肠道AMS活性：以每毫克在37 ℃与底物作用30 min，以水解10 mg淀粉定义为1个AMS活力单位。1.4.3肠道菌群取出鳙鱼中肠及肠道内容物，提取其微生物DNA，通用引物对（正向引物515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；反向引物909R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）PCR扩增各样品16S rRNA基因的V4~V5区序列。利用Illumina Hiseq2 500测序软件对所取鳙鱼样品进行高通量测序。利用FLASH软件进行原始数据拼接，Trimmomatic软件质量过滤拼接序列，质控和过滤区分后的序列质量，在相似性97%的水平上使用USE-ARCH对tags进行聚类，获得运算分类单位（OTU）。基于I-Sanger云平台分析微生物多样性，得到α多样性、β多样性、物种注释及分类学分析结果。1.5数据统计与分析采用SPSS 23.0软件对试验数据进行单因素方差分析，采用Tukey法进行多重比较分析。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵配合饵料对鳙鱼生长性能的影响（见表2）由表2可知，F100组鳙鱼FBW、WGR、SGR显著高于F0组（P0.05），F50组鳙鱼的SR为91.67%，显著高于F0组和F100组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.015.T002表2发酵配合饵料对鳙鱼生长性能的影响组别IBW/gFBW/gWGR/%SGR/(%/d)SR/%F0组69.82±1.45130.85±2.36b87.64±6.65b1.50±0.08b66.67±1.67bF50组70.81±1.48140.95±0.57b99.23±4.30ab1.64±0.05ab91.67±1.67aF100组71.94±1.89153.76±4.41a113.90±6.44a1.81±0.07a65.00±2.89b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2发酵配合饵料对鳙鱼肠道消化酶活性的影响（见表3）由表3可知，F100组鳙鱼肠道PTS、AMS活性显著高于F0组、F50组（P0.05），F100组鳙鱼肠道LPS活性显著高于F50组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.015.T003表3发酵配合饵料对鳙鱼肠道消化酶活性的影响组别PTS/(U/mg prot)LPS/(U/g prot)AMS/(U/mg prot)F0组6 556.90±228.02b2.62±0.11ab8.95±0.21bF50组5 575.36±482.10b2.22±0.19b10.04±0.42bF100组14 713.39±292.30a3.14±0.12a15.15±0.37a2.3发酵配合饵料对鳙鱼肠道菌群的影响2.3.1发酵配合饵料对鳙鱼肠道菌群Alpha多样性和OTU数量的影响（见表4、图1）由表4可知，各发酵配合饵料处理组的覆盖度在99.88%~99.93%，表明各处理组测序量充足，可以真实反映鳙鱼肠道菌群的情况。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.015.T004表4鳙鱼肠道菌群Alpha多样性指数项目组别Shannon指数Simpson指数Ace指数Chao1指数覆盖度/%肠道F0组4.15±0.05a0.06±0.01b635.40±4.94a634.67±2.74a99.93±0.04F50组2.68±0.31b0.20±0.03b559.59±4.84b558.13±5.89b99.90±0.02F100组2.47±0.05b0.39±0.06a553.82±3.81b548.56±6.89b99.89±0.03肠道内容物F0组2.65±0.09a0.19±0.03b154.58±2.87c154.00±5.74c99.92±0.03F50组1.26±0.11b0.55±0.04a360.67±5.15a371.02±7.65a99.91±0.04F100组1.09±0.02b0.65±0.09a215.29±3.46b212.90±3.03b99.88±0.02随发酵饵料替代比例增加，鳙鱼肠道及肠道内容物中Shannon指数降低，F50组和F100组组鳙鱼肠道及肠道内容物中Shannon指数显著低于F0组（P0.05）；鳙鱼肠道及肠道内容物中Simpson指数明显增加，F100组鳙鱼肠道Simpson指数显著高于F0组和F50组（P0.05），F50组和F100组鳙鱼肠道内容物中Simpson指数显著高于F0组（P0.05）。F50组鳙鱼肠道内容物Ace指数显著高于F0组和F100组（P0.05）。由图1可知，试验3组鱼肠道和肠道内容物样品共有186个OTUs，其中55个共同OTUs，占所有样品OTU总数的29.57%。F0组和FN0组中特有OTU最多，分别为113和23，随着饵料发酵比例的增加，特有的OTU逐渐降低，表明发酵配合饵料的添加使鳙鱼肠道微生物群落数量降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.015.F001图1鳙鱼肠道菌群OTU数量韦恩图注：F0为0%发酵饵料组肠道，F50为50%发酵饵料组肠道，F100为100%发酵饵料组肠道；FN0为0%发酵饵料组肠道内容物，FN50为50%发酵饵料组肠道内容物，FN100为100%发酵饵料组肠道内容物；下图同。2.3.2发酵配合饵料对鳙鱼肠道菌群组成的影响（见图2、图3）由图2可知，在门水平上，从肠道及肠道内容物中共检测出厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻细菌（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）及其他未被分类的细菌。F0组、F50组和F100组的优势门相同，为厚壁菌门（48.21%、82.60%和88.17%）、变形菌门（9.03%、4.31%和2.85%）、浮霉菌门（21.86%、8.18%和5.17%）。FN0组、FN50组、FN100组的优势门为厚壁菌门（60.91%、92.66%和88.17%）和变形菌门（9.03%、4.31%和2.85%）。随发酵饵料替代比例的增加，与F0组和FN0组相比，厚壁菌门的丰度在F50组、F100组及FN50组、FN100组具有上升趋势；肠道中浮霉菌门、变形菌门和放线菌门丰度明显降低，肠道内容物中变形菌门丰度明显降低，且FN50组变形菌门相对丰度最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.015.F002图2门水平下鳙鱼肠道菌群组成由图3可知，在属水平上，从肠道中共检测出乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、杆菌属（Bacillus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、梭状芽孢杆菌（Clostridium_sensu_stricto）、肠杆菌属（Enterobacter）等属及其他未被分类的细菌。F0组、F50组、F100组的优势门相同，为乳杆菌属（10.93%、57.67%、62.10%）、乳球菌属（25.02%、13.61%、13.71%）和杆菌属（0.31%、3.90%、8.25%）。FN0组、FN50组、FN100组的优势属为乳杆菌属（41.66%、76.22%、81.77%）和乳球菌属（15.54%、13.83%、2.11%）。随发酵饵料替代比例的增加，肠道及肠道内容物中，乳杆菌属丰度上升明显，乳球菌属丰度降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.015.F003图3属水平下鳙鱼肠道菌群组成2.3.3鳙鱼肠道微生物的β多样性分析（见图4）由图4可知，F0组与F50组、F100组之间相距较远，区分较明显，表明F0与F50、F100组之间的物种相似度较低。F0组与F50组、F100组间存在明显差异，FN0组与FN50组、FN100组也存在明显差异。F50组与F100组、FN50组与FN100组间相距较近，表明其物种间相似度较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.015.F004图4鳙鱼肠道微生物的β多样性指数注：不同颜色的点代表不同类型和分组的样本，两个样本点间的关系越近，表明两个样本的物种组成越相似。3讨论3.1发酵配合饵料对鳙鱼生长性能和存活率的影响研究表明，经益生菌发酵的饵料营养均衡，可以促进水产动物的消化和吸收，改善生长性能[8-9]。魏逸峰等[4]以10%、20%发酵饵料替代配合饵料，发现鳙鱼的WGR显著增加。王经远等[6]研究发现，以50%发酵豆粕替代复合植物蛋白质源能够显著提高团头鲂幼鱼的WGR、SGR和蛋白质效率，降低饵料系数。本研究中，随发酵饵料替代比例增加，鳙鱼生长性能提高，F100组鳙鱼WGR及SGR显著高于F0组，与上述研究结果一致。原因可能是在微生物发酵过程中，饵料中抗营养因子含量降低及大分子蛋白被降解为小肽、氨基酸等易吸收的物质，从而提高饵料利用率，改善生长性能[10]。本研究发现，发酵饵料替代比例为0和100%时，鳙鱼的SR显著低于50%替代组。黄河等[11]在大口黑鲈上的研究发现，40%发酵豆粕替代鱼粉组的SR显著低于其他各组，与本试验的研究结果一致。原因可能与养殖环境水质、鱼种等有关[12]。3.2发酵配合饵料对鳙鱼肠道消化酶活性的影响本研究表明，鳙鱼肠道PTS、AMS及LPS活性随着发酵替代比例增加呈上升趋势，且F100组肠道PTS、AMS活性显著高于F0、F50组。因此，发酵饵料可以在一定程度上提高鳙鱼肠道酶活性。与在鲤鱼[13]、南美白对虾[14]、凡纳滨对虾[15]中的研究结果相似。张来荣等[16]在克氏原螯虾中的研究发现，饵料中添加1%的微生物菌剂和发酵增效剂可以提高肠道消化酶的活性，原因可能与益生菌发酵产生的营养物质可以促进消化酶分泌，进而促进营养物质的消化吸收有关[17]。张海涛等[18]研究表明，新型厨余发酵蛋白饵料替代鱼粉比例为60%时，泥鳅的肠道微生态环境得到改善，消化酶活性提高。Salinas等[19]研究发现，与单一菌种相比，复合菌群能够更有效提高凡纳滨对虾免疫性能。结果表明，发酵配合饵料中的益生菌可能通过改善肠道的微生态平衡，从而提高其消化酶活性。3.3发酵配合饵料对鳙鱼肠道健康的影响袁春营等[14]研究发现，发酵饵料能够明显提高南美白对虾肠道菌群的Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数及Ace指数等。何娇娇等[20]研究发现，不同替代比例发酵豆粕对大黄鱼肠道Chao1指数、Shannon及Simpson指数等均无显著性差异。黄河等[11]在研究大口黑鲈幼鱼上也有相似的结果。本试验中，随发酵配合饵料比例增加，鳙鱼肠道中Shannon指数、Ace指数及Chao1指数降低，Simpson指数明显增加；肠道内容物中Simpson指数、Ace指数及Chao1指数提高。推测可能是肠道及肠道内容物中微生物相互作用，共同维持肠道的稳定。鱼类肠道菌群与其生长密切相关，对肠道中营养物质的消化吸收、维持肠道健康具有重要作用。在门分类水平上的菌群丰度中，厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门是肠道主要的优势类群[21-23]。在其他水生动物，如罗非鱼[24]、草鱼[25]和洛氏鱥[26]等也有相似研究结果。本试验中，鳙鱼肠道及肠道内容物中优势菌门有厚壁菌门、变形菌门，均为鱼类肠道主要的细菌门类，与上述研究结果相似。厚壁菌门尤其是芽孢杆菌属是消化食物残余代谢的主要细菌[27]，能够促进消化，提高营养吸收效率，也是一类重要的防治病害的微生物，能够产生抗菌物质诱导提高宿主的抗病能力[28]。变形菌门包含大量的病原菌，会破坏肠道微生态环境，导致肠道菌群失衡，增加机体患病可能性[29]。韩少锋[30]研究发现，变形菌门属于致病菌，含量过高会导致罗非鱼腐败。本研究中，随发酵配合饵料比例的增加，厚壁菌门丰度具显著增加趋势，但F100组较F50组增加相对不明显，而FN50组厚壁菌门相对丰度明显高于FN100组，鳙鱼肠道中变形菌门丰度降低，FN50组变形菌门丰度最低。结果表明，本试验条件下，50%替代比例组更能增加鳙鱼肠道有益菌群含量，降低有害菌群含量，对维持鳙鱼肠道微生态环境具有积极效果，能减少鳙鱼患病可能性。本试验中，在属分类水平上，乳杆菌属、乳球菌属占绝对优势，随发酵配合饵料比例增加，乳杆菌属占比增加，乳球菌属明显降低。乳杆菌等益生菌能够增强动物机体免疫功能，其机理可能是通过改善肠道微生态环境和自身分泌免疫激活剂实现[31]。乳球菌作为一种条件致病菌，是引发鱼类肠道疾病的来源之一[32]。王森等[33]研究发现，乳球菌属作为病鱼体中的优势细菌，会引起大竹荚鱼死亡。适当添加益生菌能够提高鳙鱼肠道有益菌群的占比，降低有害菌群的占比，调节菌群平衡，从而改善肠道微生态环境，维持肠道健康。饵料中添加酵母菌、芽孢杆菌等益生菌发酵饵料，能够抑制有害菌生长，改善鱼类肠道菌群平衡，提高鱼类肠道优势菌群的数量[34-35]。肠道菌群的多样性减少主要是由于厚壁菌门等有益菌群占比减少、有害菌群占比增加造成。有益菌群占比的增加可以增强鱼体免疫力，加快肠道屏障的完全程度，控制其他肠道特殊微生物占比，提高其肠道免疫状态。Bagheri等[36]研究发现，使用添加益生菌发酵饵料投喂虹鳟鱼苗，能够增加肠道菌群微生物数量。因此，使用发酵饵料替代全价配合饵料喂养鳙鱼，能够有效提高鳙鱼肠道微生物数量，增加肠道内有益菌群占比，降低有害菌群占比。4结论本试验条件下，适当增加发酵饵料替代比例，可以有效增加鳙鱼肠道菌群多样性，提高微生物多样性指数。当发酵配合饵料替代比例为100%时，可以明显提高鳙鱼增重率、特定生长率及肠道中的消化酶活性；当替代比例为50%时，能够显著提高鳙鱼存活率，增加肠道有益菌群占比，降低有害菌群占比，调节肠道菌群平衡。