微生物源蛋白酶由微生物培养发酵获得。由于微生物种类繁多、来源广泛，且繁殖速度快、易培养，使微生物源蛋白酶具有专一性强、生产工艺简单、成本低、安全高效等特点[1-2]。在饲粮生产中应用微生物源蛋白酶，可以降低饲料中抗营养因子的抑制作用，促进动物体对蛋白质的吸收利用，提高动物生长性能和免疫力，改善肠道健康，降低养殖成本，提高经济效益[3-4]。但由于微生物源蛋白酶的加工条件、饲料原料组成及动物品种不同，造成微生物源蛋白酶使用效果不一[5]。因此，本文介绍微生物源蛋白酶的分类及特点，论述饲用产蛋白酶微生物的筛选及条件优化，分析微生物源蛋白酶的动物营养调控技术，以期为微生物源蛋白酶的合理、高效利用提供参考。1微生物源蛋白酶的分类及特点1.1微生物源蛋白酶的分类微生物源蛋白酶根据其作用的最适pH值，可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶[6]。微生物源酸性蛋白酶主要分为两类，一类是由青霉、曲霉、根霉产生的酸性蛋白酶，作用方式类似胃蛋白酶；另一类是由毛酶和栗疫霉产生的酸性蛋白酶，作用方式类似凝乳酶[7]。微生物源酸性蛋白酶可将大分子蛋白质降解为多肽，有效促进饲料中的蛋白质类营养物质的吸收利用，但其热稳定性差，在饲料中添加效果不明显[8]。微生物源中性蛋白酶多数为金属酶，是微生物源蛋白酶中最不稳定的酶[9]。微生物源中性蛋白酶的热稳定性较差，但也有研究筛选出了耐高温微生物源中性蛋白酶[10]。微生物源的中性蛋白酶主要应用于水产饵料，原因是水产动物的肠道pH值趋于中性，在水产动物饵料中添加微生物源中性蛋白酶可以提高水产动物的消化能力，促进营养物质的吸收利用，降低氨氮排放[11]。微生物源碱性蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶，可将动植物蛋白质水解成易吸收的小肽[12]。目前，微生物源碱性蛋白酶主要应用于发酵饲料中，可钝化胰蛋白酶抑制剂，促进蛋白质的吸收利用，还可将蛋白质水解成末端是疏水氨基酸的小肽，改善饲粮的适口性[13]。微生物源蛋白酶根据其微生物来源不同又可分为细菌蛋白酶和真菌蛋白酶。细菌蛋白酶的主要产酶菌种是枯草芽孢杆菌、乳酸菌和大肠杆菌等，真菌蛋白酶的主要产酶菌种是青霉菌、镰刀菌、曲霉菌和酵母等。其中产酸性蛋白酶的菌种主要有烟曲霉、红曲酶、黑曲霉等[14]；产中性蛋白酶的菌种主要有米曲霉、弗氏链霉菌、厌色链霉菌、芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等[15]；产碱性蛋白酶的菌种主要有黄曲霉、冠状耳霉、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等[16]。1.2微生物源蛋白酶的特点微生物源蛋白酶具有生长周期短、易培养、生产成本低、微生物种类繁多、易筛选的优点，能够产生多种蛋白酶；易分类纯化，可广泛应用于工业生产；易突变，有利于开发新菌种。但微生物源蛋白酶存在难以分离单一的纯度较高的酶、产蛋白酶种类不稳定、易受培养环境影响、易在胃环境中被破坏、不耐受高温质粒的缺点[17-18]。2饲用产蛋白酶微生物的筛选及条件优化2.1饲用产蛋白酶微生物的筛选产蛋白酶的微生物种类繁多，但作为饲用菌株应具备高产、无毒和无致病性等特点，还要考虑加工条件、原料组成及动物生理等因素。因此，热稳定性、最适pH值范围、作用位点、底物适配性及作用效率成为饲用产蛋白酶微生物筛选的主要条件[19]。目前，饲用产蛋白酶微生物应用较多的是芽孢杆菌。芽孢杆菌所产蛋白酶具有水解蛋白、溶解弹性纤维、分解角蛋白等多种作用，能够抑制大肠杆菌、单增李斯特菌、鼠疫杆菌等病原菌的生长，并产生多种活性次级代谢产物[20-21]。赵龙妹等[22]筛选出一株产蛋白酶特基拉芽孢杆菌，发现其具有弱酸、中性、弱碱稳定性和高温耐受性，可作为新型饲料添加剂使用。除芽孢杆菌外，曲霉菌、酵母菌、乳酸杆菌等也是饲用产蛋白酶的优良菌株。魏满红[23]从山羊瘤胃液、枯草、腐木、酒糟、油桃、酶制剂、发酵粉中分离并筛选出6株产蛋白酶的酵母菌株，分别为热带假丝酵母菌（Y42、Y45）、毕赤酵母菌（Y6、Y18）、酿酒酵母菌（Y27、Y34）。于豪杰[24]从饲料草、青贮饲料、仔猪粪便等分离并筛选出产蛋白酶活性高、生理生化性能优良、抑菌能力强、耐胆盐、在胃肠道中活性高且具有广谱抑菌性的产蛋白酶乳酸菌，分别为食窦魏斯氏菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。2.2饲用微生物蛋白酶的产酶条件优化宋立立等[25]对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的发酵条件进行了优化，结果表明，在麦芽糖添加量8%、蛋白胨添加量8%、氯化钙添加量8 g/L、发酵温度37 ℃、初始pH值7.0的条件下，枯草芽孢杆菌所产的中性蛋白酶酶活可达420.36 U/mL。王鼎等[26]筛选出一株产蛋白酶米曲霉菌并对其产酶条件进行了优化，结果表明，在接种量4%、温度29 ℃、时间55 h的条件下，米曲霉菌蛋白酶酶活可达527.57 U/mL。姜芳芳等[27]研究表明，在碳源为可溶性淀粉、氮源为酵母膏、培养液起始pH值为7.0、培养温度为37 ℃、接种量2%、培养时间48 h的条件下，丁酸梭菌C.L24产蛋白酶酶活可达68.35 U/mL。3微生物源蛋白酶的动物营养调控技术3.1促进动物体对蛋白质的吸收利用，提高生长性能饲料中的微生物源蛋白酶可有效降低饲料中不可消化氨基酸的比例，提高动物对营养物质的利用率[28]。潘进权等[29]研究表明，黑豆粕经含桔青霉蛋白酶的复合酶制剂酶解后，多肽得率可以达到82.44%，基本上保持了黑豆粕蛋白的氨基酸组成，表明微生物蛋白酶可有效提高豆粕的营养价值。戈冰洁[30]研究表明，在日粮中添加150、300、600 mg/kg黑曲霉蛋白酶可显著提高14~28 d种鸽的平均日增重，添加600 mg/kg黑曲霉蛋白酶可显著提高56日龄乳鸽体重，添加150、300 mg/kg黑曲霉蛋白酶可显著提高粗蛋白质的表观利用率，从而提高种鸽和乳鸽的生长性能。秦魁[31]研究发现，在60周龄蛋鸡日粮中添加300 mg/kg枯草芽孢杆菌蛋白酶制剂可显著提高蛋鸡的平均日采食量，具有提高产蛋后期蛋鸡产蛋率的趋势，表明枯草芽孢杆菌蛋白酶可以提高蛋鸡生产性能。此外，微生物源蛋白酶分解的营养物质还可以刺激机体内源酶的分泌，或与内源酶协同作用于饲料中的营养物质，改善其吸收和利用，从而有效提高动物生长性能。Zuo等[32]研究表明，饲料中添加微生物蛋白酶可显著提高断奶仔猪胃蛋白酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶的活性，从而促进仔猪生长。3.2降低饲料中抗营养因子的抑制作用饲料中的蛋白类抗营养因子主要包括抗原蛋白、蛋白酶抑制因子、凝集素和醇溶蛋白等，容易破坏动物肠道结构，影响动物肠道的消化、吸收、屏障和免疫功能[33]。蛋白酶抑制因子会降低胰蛋白酶活性，引起胰腺增生和肿大，降低蛋白质消化率；抗原蛋白会引起肠道形态结构损伤，影响动物的消化吸收功能和肠道健康；凝集素会破坏肠道结构和功能；醇溶蛋白能够包裹谷物淀粉，影响谷物淀粉的消化率[34]。而微生物源蛋白酶可有效降低饲料中蛋白类抗营养因子的含量，削弱蛋白类抗营养因子对肠道功能的不良影响，促进肠道有益微生物生长繁殖，维持肠道健康[35]。王章存等[36]使用一种分离自枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶处理豆粕，发现酶解60 min时11S球蛋白的酸性亚基等主要抗原蛋白成分即被完全水解。Wang等[37]研究表明，微生物蛋白酶对提纯的球蛋白和β-伴球蛋白的降解率可达94.74%和88.89%。陈中等[38]研究发现，枯草杆菌蛋白酶可以钝化大豆胰蛋白酶抑制因子，且最适反应条件为：反应温度40~60 ℃、pH值7.5~8.5、酶活力≥40 000 U/mL、反应时间40 min。上述研究表明，微生物蛋白酶可有效降解饲料中的蛋白类抗营养因子，提高其饲用价值。3.3提高机体免疫力蛋白质是蛋白酶的作用底物，蛋白酶可通过蛋白质合成、氨基酸代谢等途径激活机体的免疫系统[39]。而微生物蛋白酶可以通过降解β-伴大豆球蛋白，减少过敏免疫反应，促进白细胞介素-8的分泌，抑制白细胞介素-10的表达，从而提高机体免疫力[39]。此外，Kim等[40]研究发现，在断奶仔猪低蛋白日粮中添加200 mg/kg地衣芽孢杆菌蛋白酶，可降低血液白细胞数量和血清肿瘤坏死因子-α含量，从而降低仔猪炎症反应。谢应国[41]研究表明，炭疽杆菌中性蛋白酶可显著提高小鼠T淋巴细胞增殖活性，提高血清总免疫球蛋白G的水平，增强Th2型体液免疫为主的免疫应答。3.4改善肠道健康微生物源蛋白酶可通过提高蛋白质利用率，减少肠道中未消化蛋白质的异常发酵，减少蛋白质发酵产生氨、组胺、毒素等刺激性物质，减缓肠道损伤，降低肠炎、腹泻等肠道疾病的发生率[42-43]。微生物源蛋白酶还可降解致敏蛋白和抗营养因子，缓解肠道过敏性损伤，维护肠道结构和功能[44]。此外，微生物源蛋白酶保留了微生物的部分特性，具有一定的抑制有害微生物生长的作用，从而维持肠道健康。张娟娟等[45]在虹鳟低鱼粉饵料中添加一种来自铜绿假单胞杆菌的耐高温微碱性丝氨酸蛋白酶，结果发现，饵料中添加微生物源蛋白酶可显著提高虹鳟胃、肠蛋白酶活性及肠道皱襞高度、面积，从而改善虹鳟肠道组织结构和功能。3.5减少环境中有害气体排放畜禽养殖过程中排放的有害气体主要包括氨气、硫化氢、一氧化氮等，这些气体主要由畜禽排泄物中未被消化吸收的蛋白质发酵释放。而微生物源蛋白酶可提高蛋白质利用率，降低排泄物中的蛋白质含量，从而减少环境中氮的排放[46-47]。Ghazi等[48]发现，在豆粕中添加曲霉属真菌源蛋白酶可显著提高肉仔鸡氮的表观回肠消化率和全消化道的表观存留率。Pan等[49]研究表明，补充微生物源蛋白酶可以提高玉米-豆粕日粮中蛋白质的利用率，抑制氨气、一氧化氮等气体形成，从而降低环境污染。4展望在饲料中添加微生物源蛋白酶，具有促进动物体对蛋白质的吸收利用、提高生长性能、降低饲料中抗营养因子的抑制作用、提高机体免疫力、改善肠道健康、降低环境污染等作用。但不同微生物源蛋白酶产品由于菌种、生产技术、活性、品控等不同，使用效果差别较大。可以充分利用现代生物技术，筛选、改造和设计产蛋白酶含量高的菌种，生产耐热性好、底物适用性广、作用效率高的饲用微生物源蛋白酶，使饲用微生物源蛋白酶在动物生产中的应用前景更加广阔。