金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一种非常普遍的食源性条件致病菌[1]，感染SA的猪常出现流涕气喘、皮肤发炎等症状，健康状况严重下降，导致巨大的经济亏损。恶唑烷酮类药物是一类全人工合成药物，可有效抑制葡萄球菌等革兰阳性球菌的生长，被称为“治疗革兰氏阳性菌救命药”[2]。其中，利奈唑胺（linezolid，LZD）是一种新型抗菌药物，由于其独特的作用部位和作用方式，不易与其他药物发生交叉耐药，主要用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的治疗[3]。理论上，由于天然耐药基因库缺少，对利奈唑胺的耐药现象本不应出现。但近些年来由于抗菌药物滥用，SA的耐药程度与日俱增，引发肉类食品质量安全问题，严重威胁人类健康[4-5]。为解决耐药菌持续增多的问题，农业农村部第194号公告提出，自2020年7月1日起，我国将实施全面禁抗，即饲料生产企业不能再生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料[6]。本试验分离并培养来自成都市周边某屠宰场的猪源SA，测量利奈唑胺等多种抗菌药物的最小抑菌浓度，并进行恶唑烷酮类耐药基因的检测，探究该地区禁抗两年后猪场SA耐药特征的变化规律。本研究旨在为规模猪场内抗菌药物的使用以及四川省成都市周边地方防治SA提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验设备立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、恒温培养箱（上海蓝豹试验设备有限公司）、恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、高速离心机（热电实验设备有限公司）、紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）、显微镜（奥林巴斯有限公司）以及三槽PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统（成都百乐科技有限公司）。1.1.2培养基及试剂金黄色葡萄球菌显色培养基（第二代）购自青岛海博生物科技有限公司；脑心浸出液肉汤（BHI）购自北京陆桥技术股份有限公司。培养基均按说明书要求制备。革兰氏染液（北京兰杰柯科技有限公司），细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Mastermix（北京天根生化科技有限公司），核酸染料（北京金博益生物技术有限公司），DNA Marker DL 2000（北京博迈德生物技术有限公司），甘油（成都长聊化工试剂有限公司）。1.1.3抗菌药物及溶剂利奈唑胺（LZD）、氯霉素（CAC）、氟苯尼考（FFC）、环丙沙星（CIP）、利福平（RFP）、红霉素（ERY）、庆大霉素（GM）、磺胺甲恶唑（SMZ）、克林霉素（CLI）购自上海麦克林生化科技有限公司，左氧氟沙星（LVX）购自北京索莱宝科技有限公司。甲醇、醋酸购自成都长聊化工试剂有限公司，乙醇购自成都市克隆化学品有限公司。1.2样品采集试验样品于2022年1月采集自四川省成都市周边某食品屠宰场。采样前将高压灭菌过的BHI肉汤培养基分装于样品管中，采样时使用无菌一次性棉签在猪鼻腔等处中蘸取分泌物，放入样品管中，并标注编号和日期。样品采集完毕后，置于37 ℃恒温振荡摇床培养24 h，和50%的甘油水溶液以1∶1的比例混合，放于-20 ℃冰箱保存。1.3SA的分离与鉴定用接种环蘸取少量样品菌液，在显色培养基上划线，37 ℃培养24 h。挑取典型菌落于3 mL BHI肉汤中，置37 ℃恒温振荡摇床单克隆培养24 h后，再次用接种环蘸取菌液并在显色培养基上划线培养。重复该操作至平板上无其他颜色的杂菌，可初步分离得到SA。相比传统方法使用的甘露醇氯化钠培养基或BP培养基等，该显色培养基上金葡菌的菌落形态更为典型，分离率也更高[7-8]。1.3.1革兰氏染色鉴定挑取典型菌落进行革兰氏染色[9]，在光学显微镜下观察菌落形态及染色情况。1.3.2nuc基因鉴定1.3.2.1引物设计nuc基因编码金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的基因[10-11]，由SA特有。根据NCBI上该基因的全序列，设计该基因引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。nuc-F：CAAGTCTAAGTAGCTCAGCA；nuc-R：CGTT-GTCTTCGCTCCAAATA，目的片段长度516 bp。1.3.2.2PCR扩增nuc基因20 μL反应体系：Taq酶10 μL、ddH2O 7 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL。扩增条件：94 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循环30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃条件下保存。将所得产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。1.4药敏试验1.4.1菌液准备接种环挑取显色培养基上呈典型紫红色凸起的菌落，将其置于3 mL BHI肉汤中，37 ℃恒温摇床振荡培养3~4 h。取样用紫外分光光度计测定，当OD600 nm值在0.08~0.12之间，可认为该菌液浓度为1×108 CFU/mL，将菌液稀释100倍。1.4.2抗菌药物制备（见表1）用分析天平准确称取各个抗菌药物，并用相应的溶剂溶解，配制成浓度为512 mg/L的母液[12-13]。将母液采用滤器过滤，过滤后的抗菌药物置于灭菌的10 mL离心管内（现配现用）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.T001表1抗菌药物及其对应溶剂Tab.1Antibacterial drugs and corresponding solvents药物名称溶剂药物名称溶剂利奈唑胺甲醇环丙沙星蒸馏水磺胺甲恶唑甲醇左氧氟沙星醋酸氯霉素甲醇红霉素95%乙醇氟苯尼考甲醇庆大霉素蒸馏水利福平甲醇克林霉素蒸馏水1.4.3最小抑菌浓度（MIC）测定采用微量肉汤稀释法测定以上10种药物对16株金黄色葡萄球菌的MIC，具体操作步骤和判定方法参考2013年美国临床和实验室标准协会抗菌药物敏感性实验标准[14]。菌液和药物添加完毕后，将96孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察试验结果。1.5金黄色葡萄球菌的恶唑烷酮类耐药基因检测1.5.1细菌DNA提取无菌条件下挑取利奈唑胺耐药株单菌落，涂布于金葡菌显色培养基或LB琼脂培养基，37 ℃培养20-24 h。依据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书对耐药株进行DNA提取。1.5.2cfr、optrA和poxtA基因的检测1.5.2.1引物设计（见表2）根据参考文献[15-16]，设计cfr、optrA和poxtA基因引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.T002表2目的基因PCR引物序列Tab.2PCR primer sequence of target gene引物名称引物序列(5'→3')引物长度/bpcfr-FTGAAGTATAAAGCAGGTTGGGAGTCA746cfr-RACCATATAATTGACCACAAGCAGCoptrA-FTACTTGATGAACCTACTAACCA419optrA-RCCTTGAACTACTGATTCTCGGpoxtA-FGGTCTGACTGGCTTGTTTTGCT1 629poxtA-RATAAGGTCGGTATTGTCGGCGT1.5.2.2PCR扩增cfr、optrA和poxtA基因20 μL反应体系：Taq酶10 μL、ddH2O 7 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL。cfr扩增条件：94 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环30次；72 ℃ 10 min。optrA扩增条件：94 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，循环30次；72 ℃ 10 min。poxtA扩增条件：94 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃ 10 min。试验设阴性对照和阳性对照。将所得产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，若试验组观察到目标条带则表明菌株具有相应的耐药基因。2结果与分析2.1SA的分离与鉴定2.1.1SA形态学鉴定（见图1、图2）由图1可知，SA在显色培养基上呈紫色、不透明、凸起菌落。由图2可知，光学显微镜下观察到SA呈球形，聚集排列为葡萄串状，无芽孢、鞭毛，经革兰氏染色呈蓝紫色。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.F001图1SA在显色培养基上的菌落形态Fig.1Colony morphology of SA on chromogenic mediumXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.F002图2革兰氏染色后的SAFig.2SA after Gram staining2.1.2SA nuc基因鉴定（见图3）由图3可知，将PCR扩增所得产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，可观察到516 bp处目标条带。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.F003图3SA nuc基因鉴定结果Fig.3Identification result of nuc gene of SA注 ： M：DL 2000 DNA Marker；1、2、3、4：阳性菌株。2.1.3SA检出情况共随机采集猪源样本137份，其中16份检出SA，检出率为11.7%；检出率与采集部位无直接联系。2.2药敏结果（见表3、图4、图5）药敏结果显示，SA对大环内酯类药物、氨基糖苷类药物和林可霉素类药物耐药严重，16株SA对红霉素、庆大霉素和克林霉素均耐药；对苯丙醇类药物耐药程度较大，其中对氯霉素和利福平均不敏感，对氟苯尼考的耐药率达到68.75%；对氟喹诺酮类药物较为敏感，其中对环丙沙星的耐药率为25%，对左氧氟沙星的耐药率为31%；对磺胺类药物耐药现象也较为明显。相比之下，本次分离得到的SA对利奈唑胺最敏感，耐药率仅为6.25%。本次分离得到的16株SA存在明显的多重耐药现象。其中，3株菌对8种抗菌药物耐药，占18.75%；2株菌对7种抗菌药物耐药，占12.5%；5株菌对6种抗菌药物耐药，占31.25%；5株菌对5种药物耐药，占31.25%；1株菌对4种药物耐药，占6.25%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.T003表310种抗菌药物对16株猪源SA的MICTab.3MIC of 10 antibacterial agents against 16 strains of SA from pigs药物类别药物名称判定标准/(mg/L)敏感数/株中介数/株耐药数/株敏感(S)中介(I)耐药(R)恶唑烷酮类利奈唑胺≤4—≥81231苯丙醇类氯霉素≤816≥32088氟苯尼考≤816≥324111利福平≤12≥40160氟喹诺酮类环丙沙星≤12≥4844左氧氟沙星≤12≥4529大环内酯类红霉素≤0.51~4≥80016氨基糖苷类庆大霉素≤48≥160016林可霉素类克林霉素≤0.51~2≥40016磺胺类磺胺甲恶唑≤38—≥76646XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.F004图416株SA对10种抗菌药物的耐药率Fig.4Drug resistance rate of 16 strains of SA to 10 antibacterial agentsXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.F005图5SA的多重耐药现象Fig.5Multiple drug resistance in SA2.3恶唑烷酮类耐药基因检测结果（见图6、图7）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.F006图6optrA基因鉴定结果Figure 6Identification result of optrA gene注 ： M为DL 2000 DNA Marker；1为阴性对照；2为阳性对照；3为样品。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.013.F007图7poxtA基因鉴定结果Fig.7Identification result of poxtA gene注 ： M为DL 2000 DNA Marker；1为样品；2为阳性对照；3为阴性对照。用特异性引物进行PCR扩增后，经电泳凝胶成像系统成像。4株利奈唑胺非敏感株均检出optrA基因，2株检测出poxtA基因，未检测出cfr基因。3讨论3.1SA的致病性SA是一种极为普遍的人畜共患条件性致病菌，拥有多种毒力性基因，感染SA的猪常常出现流涕气喘、皮肤发炎等症状，健康状况严重下降，导致养猪业上巨大的经济亏损；而人若误食了感染SA的猪肉会造成不同程度的食物中毒，导致呕吐、腹泻、化脓等症状，严重者甚至死亡。3.2SA的耐药情况本试验从成都市周边某屠宰场采集猪源SA样本137株，经筛选后共得到16株SA，检出率高达11.7%，表明该地区的食品厂肉猪的金葡菌感染依旧是一个不容小觑的问题。检测利奈唑胺等10种药物的MIC，发现金葡菌对大环内酯类药物、氨基糖苷类药物和林可霉素类药物耐药严重，对苯丙醇类药物耐药程度较大，对氟喹诺酮类药物较为敏感，对恶唑烷酮类药物最为最敏感，对利奈唑胺耐药率仅为6.25%。相比禁抗前，SA大多恢复了对利奈唑胺药物的敏感性，但本试验分离的SA仍然存在明显的多重耐药现象，最多可同时对8种抗菌药耐药，对6种和5种抗菌药物同时耐药的菌株最多，各占31.25%。畜牧养殖场和屠宰场应遵照禁抗原则，科学合理地使用药物杀灭SA；并保证猪场的卫生条件，及时清理、定时通风、按时消毒；也应做到定期检查肉猪及其他家禽、家畜的健康状况，倘若一旦发现有细菌感染的情况立刻进行处理，防止感染规模的不断扩大，造成更严重的经济亏损等后果。3.3SA的恶唑烷酮类耐药基因恶唑烷酮类药物在化学结构上有恶唑烷二酮母核，是一种蛋白质合成抑制剂，对革兰阳性球菌具有较强的抗菌活性，被称为“治疗革兰氏阳性菌救命药”。利奈唑胺是一类近年研制的新型药物，属于恶唑烷酮类，作用于细菌翻译的起始，通过与细菌核糖体的50S亚单位结合，抑制其与mRNA的连接，阻断细菌形成70S翻译起始复合物，从而抑制细菌蛋白质的合成，发挥抗菌作用。然而，optrA与cfr与两个耐药基因均可以介导恶唑烷酮类与酰胺醇类药物的耐药，自从被发现以来[17-18]，已在兽医领域和人医临床领域受到国内外的广泛关注。而在这之后新发现的poxtA基因，与optrA基因编码的蛋白具有32%的同源性，是一种新型恶唑烷酮类与氟苯尼考双重耐药基因[19]。本试验中，4株利奈唑胺非敏感株均检出了optrA基因，2株检测出了poxtA基因，表明耐药菌株也许具有不止一个耐药基因，致使其具有多种耐药性表型，使得临床抗菌药的选择变得非常有限。因此，当下对食源性金黄色葡萄球菌optrA、poxtA、cfr等3种耐药基因的严密监测刻不容缓，同时也应该加强SA恶唑烷酮类药物交叉耐药基因的扩散机制研究，为耐药基因的传播提供科学依据。4结论综上所述，本试验分离得到的猪源SA大多对利奈唑胺敏感，但细菌检出率较高且存在严重的多重耐药现象。肉猪SA感染情况依旧不容小觑，食品安全问题亟待解决。