旋毛虫病是一种由旋毛虫感染引起的典型的人畜共患病，目前已知猪、犬及羊等120种动物可感染旋毛虫病。旋毛虫（Trichinella spiralis，T. spiralis）是隶属于袋形动物门线虫纲的一种线虫，成虫寄生在宿主的肠道内，幼虫寄生在宿主的横纹肌中[1]。人食用含有幼虫囊包的未煮熟猪肉时即可感染，继而引起人发热、皮疹及面部水肿等症状，严重时可导致肺炎及心肌炎等症状[2]。旋毛虫病呈全球性分布，我国多个省份地区都曾在猪肉中检测出旋毛虫。自1964年至2011年，全球共暴发600多起旋毛虫病疫情，患病人数超过3万，死亡病例300余人，其中超过90%的病例是因食用受污染的猪肉患病[3]。旋毛虫病的检测方法众多，包括压片镜检法、膈肌消化法、Elisa法及凝集反应等，临床中较常用的方法是压片镜检法及Elisa法。本研究收集齐齐哈尔地区不同生猪定点屠宰场猪的血清样本及膈肌样本，应用Elisa法、压片镜检法、膈肌消化法及PCR法进行检查，为该地区周边猪旋毛虫的防控提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验样本2018—2021年从齐齐哈尔周边生猪定点屠宰场采集血清样本、膈肌样本各1 015份，血样、肉样编号一一对应，相同编号的样本来自同一头猪。1.1.2试剂与仪器旋毛虫抗体Elisa试剂盒购自上海莼试生物技术有限公司。胃蛋白酶购自索莱宝生物科技有限公司，盐酸购自烟台远东精细化工有限公司。高速离心机（艾本德中国有限公司）、分光光度计（上海正晃商贸有限公司）、恒温培养箱（杭州诺丁科学器材有限公司）等。1.2试验方法1.2.1样品采集从猪胴体两侧的横膈肌脚部各采集一块，记为一份肉样，每份肉样约50~100 g。采集猪新鲜血液置于离心管中，3 000 r/min离心10 min以获得血清。1.2.2Elisa法应用Elisa试剂盒检测血清样本，操作方法见说明书。1.2.3压片镜检法按照《旋毛虫诊断技术》（GB/T 18642—2021）的要求，Elisa检测结果阳性的肉样进行压片镜检。顺着肌纤维方向从肉样上至少剪出28粒燕麦粒大小的样品，均匀放在夹压玻璃板上，排成一排，每个夹压玻璃板上最多可放置16粒样品。压片放在低倍显微镜下观察，从压片一端边沿开始观察，不清晰处可用高倍镜进行观察。肌肉细胞有圆形或椭圆形包囊，且包囊中央有蜷曲的虫体，判断为形成包囊的旋毛虫；肌细胞内有呈直杆状或略微蜷曲状态虫体，判断为无包囊的虫体；发现有包囊或无包囊的虫体均可判断为旋毛虫感染。1.2.4消化法按照《旋毛虫诊断技术》（GB/T 18642—2021）的要求，Elisa检测结果阳性的肉样进行消化法检查。将肉样与等体积盐酸溶液混合，应用碎肉机进行搅拌，搅拌至不见细碎块为止。将搅拌样品取出，加入消化液，使20 mL消化液中含有1 g肉样。加热搅拌45 min，直到消化液中无肉眼可见的碎肉。不锈钢筛网放置在分液漏斗上，将样品倒入筛网中。将滤液在分液漏斗中分离30 min，使旋毛虫沉到底部，此时开启漏斗将混悬液转移到50 mL离心管中，静置10 min，弃上清液。将滤清的沉淀物倒入培养皿中，倒置显微镜观察是否含有虫体和钙化包囊。1.2.5PCR检查参考相关文献进行旋毛虫引物合成（引物序列见表1）[4]。将肉样放于灭菌离心管中，加入钢珠和适量无菌PBS缓冲液，应用研磨机进行充分研磨，基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取进行PCR的扩增。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.012.T001表1旋毛虫引物序列Tab.1Trichinella spiralis primer sequence引物名称序列（5'→3'）引物长度/bpESVF:GTTCCATGTGAACAGCAGTR:CGAAAACATACGACAACTGC127反应体系：2×PCR Mixture 10 μL、20 μmmol/L上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL、DNA样品1 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。2结果与分析2.1齐齐哈尔地区生猪定点屠宰场猪旋毛虫血清样本检查结果2.1.1不同年份生猪定点屠宰场猪旋毛虫血清样本检查结果（见表2）由表2可知，2018—2021年齐齐哈尔地区生猪定点屠宰场猪旋毛虫阳性率分别为1.57%、1.23%、1.15%、1.17%，平均阳性率为1.28%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.012.T002表2不同年份生猪定点屠宰场猪旋毛虫血清样本检查结果Tab.2Results of serum samples of Trichinella spiralis from pig slaughterhouses in different years年份阳性样本数/份样本数/份阳性率/%合计/平均值131 0151.28201842551.57201932431.23202032611.15202132561.172.1.2不同地区生猪定点屠宰场猪旋毛虫血清样本检查结果（见表3）由表3可知，2018—2021年，不同地区生猪血清样本检出率分别为富裕0.89%、甘南1.16%、拜泉1.37%、梅里斯1.27%、龙江1.25%、克山1.46%及泰来1.51%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.012.T003表3不同地区生猪定点屠宰场猪旋毛虫血清样本检查结果Tab.3Results of serum samples of Trichinella spiralis from pig slaughterhouses in different areas地区阳性样本数/份样本数/份阳性率/%合计/平均值131 0151.28富裕11120.89甘南21721.16拜泉21451.37梅里斯21581.27龙江21601.25克山21361.47泰来21321.522.2齐齐哈尔地区生猪定点屠宰场猪旋毛虫膈肌样本检查结果结果显示，Elisa阳性的对应肉样中有46.15%的肉样（6份）可通过压片镜检法发现虫体，76.92%的肉样（10份）可通过消化法检出虫体。2.3齐齐哈尔地区生猪定点屠宰场猪旋毛虫PCR检测结果（见图1）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.012.F001图1PCR检测结果Fig.1PCR test results注 ： M为DL2000 Marker；1为阳性对照；2为阳性肉样A；3为阳性肉样B。在Elisa阳性结果肉样中，仅有2个肉样通过PCR法检出阳性，检出率仅为0.20%（2/1 015）。3讨论旋毛虫主要通过食物链进行传播，也可由妊娠母猪感染后通过胎盘传染仔猪。猪旋毛虫的检测方法较多，在Elisa法未被开发前，压片镜检法和消化法是标准和法规中经常提及并使用的方法，但两种方法均因敏感性低而易造成漏检。此外，压片镜检法和消化法操作复杂，不适用于快速诊断。Elisa法测定旋毛虫被认为是目前临床中最敏感的方法[5]。Elisa是一种酶标抗体，可特异性吸附在固定相上的抗原，加入底物溶液后可与酶发生反应，加入终止液后测定OD值，并通过OD值与Cutoff值进行对比判断是否发生反应[6]。除Elisa法以外，胶体金法也逐渐应用于旋毛虫的检测，但是其性价比低于Elisa法。此外，一些分子生物学技术也逐步应用于旋毛虫检测，包括常规PCR、实时荧光定量PCR及液相基因芯片等，但上述方法对试验设施的要求较高，并且其敏感性与感染虫数量及感染时间相关，不太适用于大规模的临床检测[7]。Elisa法在我国各地旋毛虫检测工作中均有应用。王琳等[4]应用Elisa法对广东、山东及云南等各个省份的不同规模的生猪屠宰场进行了旋毛虫检测，发现旋毛虫的阳性率达到1.97%。盖文燕等[8]应用Elisa法对山东省9个市的屠宰场进行了旋毛虫抗体检测，发现2015—2017年山东省部分地区屠宰场旋毛虫阳性率分别为1.42%、1.54%及1.74%，平均阳性率为1.58%。李建云等[9]应用Elisa法对云南省昆明市疑似感染旋毛虫病的患者进行了检测，发现通过Elisa法检测发现疑似患者中的阳性率为7.1%，并且绝大多数阳性患者都存在食入生猪肉史。王春泉等[10]对云南省澜沧县26例旋毛虫病患者应用Elisa法测定其血清，发现全部检测者旋毛虫抗体为阳性。本次试验测定的齐齐哈尔地区生猪屠宰场旋毛虫平均阳性率为1.28%，阳性水平较低。旋毛虫病的发生多与食入未煮熟的猪肉有关，游晓迪等[11]对云南省人体旋毛虫病暴发疫情进行了回顾性分析调查，发现所有暴发疫情均因食入生肉而引起。翟铖铖等[12]对全球人体旋毛虫病的暴发情况进行分析，发现中国东北、云南、广西及西藏等地区时有旋毛虫疫情暴发，且均与食入生肉有关。还有研究表明，引起旋毛虫病暴发的因素不只是食入生猪肉，生食其他动物的肉也可能引发旋毛虫病，如牛肉、熊肉及狐肉等。目前，治疗旋毛虫使用的首选药物为阿苯达唑，不仅可以除去肠道内的幼虫和成虫，还能够抑制雌虫产生新生蚴，常用的剂量为20~30 mg/kg，5~7 d为一个治疗疗程[13]。旋毛虫病的防治原则是预防优于治疗，日常应注意养成良好的生活习惯，不食入生肉，做饭时要做到生熟分开[14-15]。4结论本研究结果表明，黑龙江省齐齐哈尔地区的定点生猪屠宰场旋毛虫阳性率较低。本试验数据可为齐齐哈尔地区旋毛虫的防治提供一定参考。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.012.F002