大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是世界上最珍贵的动物之一。因在地球上的生存时间久远，大熊猫又常被称为“活化石”。一直以来，研究人员开展相关的科研工作致力于更深入地了解和更好地保护大熊猫[1-4]。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是血红素过氧化物酶超家族成员。MPO的合成仅限于骨髓中的髓系细胞，存在于髓系细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，成为髓系细胞的特异性标志[5]。MPO蛋白由2条轻链和2条可变的重链组成，是一种二聚体蛋白[6]。MPO通过催化H2O2和Cl-生成次氯酸和多种自由基，参与杀灭病原微生物；当MPO释放到细胞外时，还与某些疾病的发生有关[7]。已有研究表明，MPO与动脉粥样硬化、肺癌、脑卒中以及脑膜炎等疾病相关；此外，MPO缺乏还可导致免疫缺陷[8-10]。高齐瑜等[11]首次报道了大熊猫动脉粥样硬化病例，病变主要分布于主动脉弓、腹主动脉和肾动脉等部位，血管内膜呈现泡状水肿或纤维斑块形成等病理变化。鉴于MPO与动脉粥样硬化的病理过程相关，本文通过生物信息学方法对大熊猫MPO基因编码蛋白的理化性质、蛋白质结构等进行预测和分析，为后续深入研究大熊猫MPO与大熊猫动脉粥样硬化的病理机制提供参考。1材料与方法1.1序列来源从NCBI数据库中检索大熊猫等10个物种MPO蛋白的氨基酸序列，登录号分别为：大熊猫（XP_019665645.2）、牛（AAI49473.1）、山羊（NP_001301115.1）、马（XP_014596920.1）、白尾鹿（XP_020757815.1）、绵羊（XP_042111204.1）、狮（XP_042770870.1）、虎（XP_042821844.1）、灰熊（XP_026373217.1)、北极熊（XP_040496828.1）。1.2MPO蛋白理化性质分析使用ProtParam在线工具分析大熊猫MPO蛋白的理化性质，包括MPO蛋白的分子式、氨基酸个数和组成、等电点、稳定性、脂肪指数和总平均亲水系数等。1.3亲水性和疏水性分析使用EXPASY网站（https://web.expasy.org/protscale），输入大熊猫MPO蛋白氨基酸序列，分析大熊猫MPO蛋白的亲水性和疏水性。1.4信号肽切割位点及跨膜结构预测利用SignalP-4.1进行潜在信号肽切割位点预测；使用TMHMM v.2.0在线分析大熊猫MPO蛋白跨膜结构。1.5蛋白结构分析通过PSIPRED 4.0工具预测大熊猫MPO蛋白的二级结构；在二级结构的基础上，通过SWISS MODEL预测MPO的三级结构模型。1.6系统发育树构建使用MEGA7.0软件对包括大熊猫在内的10个物种MPO蛋白序列进行比较，并构建系统发育树。1.7蛋白互作分析使用STRING数据库进行蛋白互作分析。2结果与分析2.1大熊猫MPO蛋白理化性质分析ExPAsy-ProtParam Tool分析结果显示，大熊猫MPO蛋白分子质量为81 087.17 u（81.1 ku），理论等电点为8.88；由719个氨基酸组成，其中亮氨酸（Leu）比例最高，为11.8%，组氨酸（His）的比例最低，为1.3%；负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）数为72个，正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）数为83个；分子式为C3602H5682N1028O1034S36，原子总数为11 382个；不稳定系数为44.24，属于不稳定蛋白；脂肪指数为85.06，总平均亲水系数为-0.289。大熊猫MPO蛋白的氨基酸组成见图1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.F001图1大熊猫MPO蛋白的氨基酸组成Fig.1Amino acid composition of giant panda MPO protein2.2大熊猫MPO蛋白亲水性和疏水性分析（见表1、图2）由表1、图2可知，大熊猫MPO蛋白亲水性最强的位点为第57位的酪氨酸，分值为-2.8；疏水性最强的位点是第12位的丙氨酸，分值为2.756；亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，亲水性值总和大于疏水性值总和，由此得出MPO属于亲水性蛋白。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.T001表1大熊猫MPO蛋白亲水性与疏水性氨基酸残基预测Tab.1Prediction of hydrophilic and hydrophobic amino acid residues of giant panda MPO protein蛋白名称亲水性最强氨基酸残基疏水性最强氨基酸残基亲水性氨基酸残基总分值疏水性氨基酸残基总分值氨基酸残基位点亲水性值氨基酸残基位点疏水性值MPOS57-2.800A122.756-384.945182.143XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.F002图2大熊猫MPO蛋白亲水性与疏水性分析Fig.2Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of giant panda MPO protein2.3大熊猫MPO蛋白信号肽切割位点及跨膜结构预测（见图3、图4）SignalP(v4.1）分析结果显示，大熊猫MPO蛋白C值、Y值以及S值分别为0.569、0.697和0.943；1~22位氨基酸序列的平均信号肽分值为0.853，D值为0.781。由图3可知，该蛋白含有一个信号肽序列，信号肽的剪切位点位于第22位和第23位氨基酸之间。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.F003图3大熊猫MPO蛋白信号肽切割位点结果分析Fig.3Analysis of cutting sites of giant panda MPO protein signal peptides由图4可知，TMHMM分析结果显示，大熊猫MPO蛋白不含跨膜结构，是一种非跨膜蛋白。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.F004图4大熊猫MPO蛋白跨膜结构结果分析Fig.4Analysis of transmembrane structure of MPO protein of giant panda2.4大熊猫MPO蛋白二级结构和三级结构预测（见图5、图6）由图5可知，利用ExPAsy-GORIV4.0预测大熊猫MPO蛋白二级结构，结果显示大熊猫MPO蛋白的二级结构含有α螺旋、延伸链和无规则卷曲等3种，分别占43.95％、1.25％和55.49％。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.F005图5大熊猫MPO蛋白二级结构分析Fig.5Analysis of secondary structure of giant panda MPO protein由图6可知，大熊猫MPO蛋白三级结构由α螺旋、无规则卷曲等结构折叠缠绕形成，与二级结构预测结果吻合。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.F006图6大熊猫MPO蛋白三级结构分析Fig.6Tertiary structure prediction of MPO of giant panda2.5大熊猫MPO蛋白的系统发育树（见图7）由图7可知，本研究构建了包括大熊猫在内的10个物种的MPO蛋白氨基酸序列系统发育树，结果显示，大熊猫MPO蛋白与棕熊、北极熊位于同一进化分支，氨基酸序列相似度均为97.5%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.F007图7大熊猫MPO蛋白的系统发育树Fig.7Phylogenetic tree of MPO protein of giant panda2.6大熊猫MPO蛋白互作网络分析（见图8）由图8可知，图中蛋白质分子之间的连线表示所连接的两个蛋白质之间的相互作用关系。大熊猫MPO蛋白与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、羧酸酯酶-1（carboxylesterase-1，CES1）、血浆铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CP）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，ELANE）、补体因子D （complement factor D，CFD）、runt相关转录因子1（runt domain transcription factor1，RUNX1）、细胞间黏附分子-1 （intercellular adhesion molecule，ICAM1）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等10个蛋白质均具有相互作用。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.002.F008图8大熊猫MPO蛋白互作网络分析Fig.8MPO protein interaction network analysis of giant panda3讨论3.1MPO参与动脉粥样硬化等疾病的发生过程Agner[12]于20世纪40年代首次从犬脓液中分离出MPO，并命名为绿过氧化物酶。为区别存在于乳汁中的乳过氧化物酶并反映其髓系细胞来源，该酶被重新命名为MPO[13]。MPO主要存在于中性粒细胞和巨噬细胞中，能够催化H2O2和Cl-生成次氯酸和多种自由基参与杀灭病原微生物[7]，还可通过其强大的促氧化和促炎特性参与某些疾病的发生[14]。章小兵等[15]研究发现，大鼠肝脏缺血再灌注损伤动物模型的病理机制与MPO释放增多引起的氧自由基清除障碍有关。王光彦等[16]研究表明，人冠状动脉狭窄程度与血浆MPO水平呈正相关。此外，MPO还参与动脉粥样硬化的病理过程。MPO可促进氧化修饰低密度脂蛋白（LDL）的形成，使其无法被低密度脂蛋白受体识别，但修饰后的LDL可被血管内皮细胞和巨噬细胞上的清道夫受体识别，导致内皮功能障碍和泡沫细胞形成[17]。因此，MPO水平能够反映动脉粥样硬化斑块内的氧化应激发生的程度，已被作为评估动脉粥样硬化的风险标志物[18]。有研究表明，将MPO作为靶分子抑制其活性可能是有效减轻组织氧化损伤和炎症的策略之一[19]。Cheng等[20]使用AZM198抑制MPO，减轻了血管炎症和动脉粥样硬化小鼠模型中的内皮功能障碍。病理学研究发现，大熊猫动脉粥样硬化的病变主要发生于主动脉，呈现脂质和胆固醇堆积、中膜呈现纤维化和软骨化，某些变化还与人以及其他动物有所不同[11]。因此，探讨将MPO水平作为评估大熊猫动脉粥样氧化的风险标志物，并以大熊猫MPO作为治疗动脉粥样硬化的靶点具有一定研究价值。3.2大熊猫MPO蛋白的组成与结构本研究通过对大熊猫MPO蛋白的理化性质进行预测分析，并构建包括大熊猫在内的10个物种MPO蛋白的系统发育树，预测了与MPO互作的关键蛋白。结果显示，大熊猫MPO蛋白由719个氨基酸组成。蛋白质的疏水性和亲水性对于蛋白质的结构、稳定性和功能的发挥具有重要意义[21]。本研究结果表明，大熊猫MPO蛋白是稳定的亲水性蛋白，不具有跨膜结构。大多数分泌蛋白质N末端携带有分泌信息的短肽，这种短肽被称为信号肽[22]。本研究中，大熊猫MPO蛋白在第22~23号氨基酸之间剪切后形成一个信号肽，该信号肽可能对于MPO的分泌具有重要作用。蛋白质是由氨基酸以肽键相连而形成的，其氨基酸组成是蛋白质高级结构形成的基础。蛋白质的高级结构与蛋白质分子正常功能的执行密切相关。大熊猫MPO蛋白的二级结构含有α螺旋、延伸链和无规则卷曲等3种，分别占43.95％、1.25％和55.49％。在此基础上，其三级结构再由α螺旋、无规则卷曲等结构折叠缠绕形成。由本文构建的系统发育树可知，大熊猫MPO蛋白与棕熊、北极熊处于同一进化分支。4结论本研究结果表明，大熊猫MPO蛋白由719个氨基酸组成，是一种稳定的亲水性蛋白，含有一个信号肽序列，其互作蛋白包括IL-6、TNF等。本研究结果将有助于开展MPO与大熊猫动脉粥样硬化等疾病关系的研究。