禽流感是由A型流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种禽类疾病，严重危害畜禽业发展和人类健康。其中H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，可在动物体内长期存在，也引起其他病原体的继发感染。近年来已有人感染H9N2的相关报道[1]。因此，加强对H9N2亚型AIV的监测并分析其遗传变异特点及跨种传播机制十分重要。A型流感病毒基因组有８个基因节段，其中第7个基因节段M能够编码翻译多种蛋白，包括M1基质蛋白、M2离子通道蛋白以及M42等。M1是维持病毒形态的基质蛋白[2]，也是调节病毒形态表型的决定性遗传因素[3-4]，可以与HA和NA相互作用，在病毒粒子出芽过程中起到关键作用，影响其形成和释放[5-6]。同时，M1蛋白具有型特异性，可结合内部病毒蛋白NP，二者的抗原性不同是流感病毒分型（A~D）的依据[5, 7]。研究表明，基于M1蛋白的核酸疫苗对同源或异源AIV感染均可起到保护作用[8]。此外，深入研究M1有助于为开发流感病毒新治疗靶点提供参考[9]。M2蛋白是一种典型的Ⅲ型囊膜蛋白，是AIV表面除HA、NA外的另一种抗原[10]。有研究指出，M2蛋白可以与M1蛋白Ｎ端的1~160个氨基酸相互作用，从而达到协助M1蛋白顺利出芽的目的[11-12]。M2含量虽少但具有较高的同源性，是研制流感通用疫苗的主要候选免疫原之一[13-14]。M42蛋白从结构与功能上均类似M2蛋白，但仅在一些流感病毒株中表达，并非流感病毒复制所必需[15]。本研究对2019—2022年分离的几株不同来源的H9N2亚型AIV进行M基因的遗传演化分析，以期为AIV的M蛋白相关生物学机制的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用病料采集自部分养殖场病死鸡的气管及泄殖腔分泌物。SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。1.2试剂与仪器主要试剂：AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒（康宁生命科学（吴江）有限公司）、一步法RT-PCR试剂盒（康为世纪生物科技股份有限公司）、2×Taq预混液（北京康润诚业生物科技有限公司）、反转录酶及相关试剂等（宝生物工程（大连）有限公司），琼脂糖、电泳缓冲液等（北京索莱宝科技有限公司）。主要仪器：TP350型PCR仪（TaKaRa公司）、DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）。1.3引物设计引物HA（Bm-HA-1：TATTCGTCTCAGGGAGC-AAAAGCAGGGG，Bm-NS-890R：ATATCGTCTCGTA-TTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT）、NA（Bm-NA-1：TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT，Bm-NA-1413R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGT TTTTT）、M（Bm-M-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAA-GCAGGTAG，Bm-M-1027R：ATATCGTCTCGTATT-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT）参照自Hoffmann等[16]设计的通用引物，Uni-12（AGCAAAAGCAGG）反转录引物均交由北京擎科生物科技有限公司合成。1.4试验方法1.4.1样品采集与病毒分离培养无菌条件下取有呼吸道症状、产蛋率下降的病死鸡气管、泄殖腔中的分泌物。RT-PCR扩增病毒HA和NA基因参照SuperRT One Step RT-PCR Kit进行。反应体系（50 μL）：SuperRT OneStep EnzymeMix 2 μL、2×SuperRT OneStepBuffer 25 μL、上下游引物各2 μL、模板8 μL、RNase-Free Water 19 μL。反应程序：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃终止反应。测序比对后确定为H9N2亚型AIV后，将阳性病料接种于SPF鸡胚尿囊腔，弃去24 h内死亡的鸡胚，72 h后收获尿囊液。收集具有HA效价的尿囊液，分装-80 ℃冻存。1.4.2M基因的RT-PCR扩增使用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取尿囊液中病毒RNA，逆转录成cDNA用于PCR扩增，使用2×Taq预混液扩增病毒M基因。反应体系（50 μL）：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25 μL、上下游引物各2 μL、模板2 μL、Sterile ddH2O 19 μL。反应程序：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃终止反应。1.4.3序列测定及分析PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，送至北京擎科生物科技有限公司利用测序引物进行病毒的基因序列测定。基因测序结果使用DNAStar 7.1软件包进行序列拼接（Seqman软件）、翻译（Editseq软件）、比对以及关键氨基酸位点变异分析（MegAlign软件）。通过NCBI Blastn搜索和下载各病毒基因的最相似序列以及国内H9N2亚型AIV各进化分支的经典参考序列，使用MEGA 7软件以Neighbor-joining（NJ）法绘制遗传进化树。8株H9N2亚型AIV以及其他相关毒株信息及缩写见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.003.T001表18株H9N2亚型AIV以及其他相关毒株信息及缩写Tab.1Eight strains of H9N2 subtype AIV and information and abbreviations of other related strains序号病毒分类毒株信息病毒简称1分离株A/duck/Shandong/XD1/2022(H9N2)XD12A/Chicken/Liaoning/XD2/2021(H9N2)XD23A/Chicken/Shandong/ XD3/2019(H9N2)XD34A/Chicken/Henan/XD4/2020(H9N2)XD45A/Chicken/Liaoning/XD5/2021(H9N2)XD56A/Chicken/Shandong /XD6/2022(H9N2)XD67A/Chicken/Shandong/XD7/2022(H9N2)XD78A/Muscovey duck/Guangdong/XD8/2021(H9N2)XD89经典株A/chicken/Beijing/1/1994BJ9410A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)G111疫苗株A/chicken/ Shandong/6/96(H9N2)SD69612A/chicken/Shanghai/F/98F9813A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)WJ572结果与分析2.1RT-PCR产物的凝胶电泳鉴定（见图1）由图1可知，8株分离株的PCR扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳后，出现M特异性目的条带，片段大小约为1 027 bp，与预期结果相符。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.003.F001图18株H9N2亚型M基因PCR产物电泳结果Fig.1Electrophoresis results of eight strains of H9N2 subtype M gene PCR products注 ： M为DL2000DNA Marker；1~8为XD1~XD8；阳为阳性对照；阴为阴性对照。2.2M核苷酸一致性分析（见表2、表3）由表2可知，分离株与经典株、疫苗株在M基因中核苷酸一致性主要在98%以上，为98.88%~99.90%，其中XD1与XD6、XD4与XD7对应的序列相同，但一致性仍存在差异。分析结果显示，与各分离株核苷酸一致性最高的参考序列最早来自2012年，其他毒株主要为2017年以来的病毒。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.003.T002表2与分离株的核苷酸一致性最高的参考毒株信息Tab.2Reference viruses with highest genetic identities to H9N2 viruses基因分离株核苷酸一致性最高的病毒序列一致性MXD1A/chicken/Guangdong/SIC2/2012(H9N2)99.80XD2A/Beijing/1/2017(H9N2)99.49XD3A/chicken/Hunan/10.27_YYGK48B4-OC/2018(H9N2)99.39XD4A/chicken/Guangdong/9.12_SZBJ014-O/2018(H9N2)98.88XD5A/chicken/China/832/2017(H9N2)99.29XD6A/chicken/Guangdong/SIC2/2012(H9N2)99.90XD7A/chicken/Guangdong/9.12_SZBJ014-O/2018(H9N2)99.39XD8A/eurasian coot/Shandong/W5611/2020(H5N8)99.69%由表3可知，一致性比较结果显示，8个分离株M之间的核苷酸一致性为88.0%~99.7%，氨基酸一致性为89.7%~99.7%；XD1和XD6的核苷酸与氨基酸一致性均为最高达到99.7%；XD2和XD8的核苷酸一致性最低为88.0%，氨基酸一致性为90.0%；XD5和XD8的氨基酸一致性则最低为89.7%。8株分离株与2株经典株进行M基因序列比对分析核苷酸一致性表明，XD1~XD7与G1株的一致性最高为92.7%~94.2%，XD8与BJ94株的一致性最高为93.0%；与目前市场上的疫苗株（F98株、SD696株、WJ57株）进行序列对比分析核苷酸一致性表明，XD1~XD7与WJ57株的一致性最高为96.7%~98.5%，XD8与SD696株的一致性最高为92.0%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.003.T003表3分离株与经典株、疫苗株的M基因之间的核苷酸及其推导氨基酸序列的一致性比较Tab.3Comparison of nucleotide and deduced amino acid sequences of M gene among isolates, classical strains and vaccine strains毒株XD1XD2XD3XD4XD5XD6XD7XD8BJ94G1SD696F98WJ57XD197.997.496.797.899.796.688.793.493.992.493.098.5XD298.498.495.999.698.096.088.092.092.891.091.897.6XD398.898.495.898.297.596.188.592.392.991.591.697.5XD498.897.898.196.097.098.588.891.892.790.992.096.7XD598.199.798.197.597.996.188.192.393.091.392.197.7XD699.798.899.199.198.496.789.193.794.292.793.398.6XD798.497.597.899.197.298.889.292.193.091.292.396.8XD891.090.091.090.389.791.391.393.090.192.091.088.4Bj9494.193.193.593.592.894.493.893.896.299.198.092.9G194.193.193.593.592.894.493.592.897.895.295.194.0SD69693.592.592.893.592.293.893.592.899.197.297.992.0F9893.892.893.193.892.594.194.192.298.496.398.193.1WJ5799.798.899.199.198.4100.098.891.394.494.493.894.1注 ：右上为核苷酸一致性；左下为氨基酸一致性。2.3H9N2亚型AIV M基因的系统进化树（见图2）由图2可知，M基因的遗传进化分为G1-like和BJ94-like两个分支，其中XD1~XD7分离株的遗传距离较近，均属于A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)为代表的G1-like分支。XD8属于以A/chicken/Beijing/1/1994为代表的BJ94-like分支。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.003.F002图2H9N2亚型AIV M基因的系统进化树Fig.2Phylogenetic tree of M genes of H9N2 avian influenza viruse注 ： ●分离毒株；▲经典毒株；■疫苗株。2.4分离株的M基因关键氨基酸位点分析（见表4）流感病毒的M基因包含1 027个核苷酸，其中M1蛋白由252个氨基酸编码组成，M2蛋白由97个氨基酸残基组成[13]。由表4可知，在M1与M2蛋白中，8株分离株的10个关键位点中有4个位点相对保守；其余6个位点中，XD1~XD7均与经典株不同，但与近年新出的疫苗株WJ57相同，XD8所有位点都与经典株相同。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.003.T004表4分离株M基因关键氨基酸位点分析Tab.4Analysis of key amino acid loci in M gene of isolates分离株关键性氨基酸位点M1M230379521522424221273031XD1DAKANNGVANXD2DAKANNGVANXD3DAKANNGVANXD4DAKANNGVANXD5DAKANNGVANXD6DAKANNGVANXD7DAKANNGVANXD8DTRASKDVASBJ94DTRASKDVASG1DTRASKDVASSD696DTRASKDVASF98DTRASKDVANWJ57DAKANNGVAN3讨论本研究对2019—2022年中国不同省份已接种过疫苗的养殖场分离到的8株H9N2亚型AIV进行了M序列测定、进化分析与重要位点分析。通过对8株分离株的M基因进行分析得出，从分离时间来看，一致性最高毒株最早来自2012年；从核苷酸一致性来看，8株分离株与NCBI网站上序列的一致性均在98%以上，其中与XD8的核苷酸一致性最高的毒株序列来自H5N8亚型，表明其可能是一株重组病毒。与市面上的疫苗株一致性相比，XD1~XD7与WJ57株M基因的一致性最高，XD8与SD696株的一致性最高；8个分离株M之间的核苷酸与氨基酸一致性分别为88.0%~99.7%、89.7%~99.7%。由进化树分析可知，XD1~XD7属于G1-like分支，XD8属于BJ94-like分支。Zhang等[17]对M蛋白关键氨基酸位点进行分析，结果表明，M1蛋白中的95K、224N和242N残基和M2蛋白中的21G均有可能增加AIV的感染性。而本试验分离株与经典株相比，XD1~XD7的M1蛋白发生T37A、R95K、S224N和K242N突变，M2蛋白发生D21G突变，与上述研究结论相符。研究显示，当M1蛋白的N30D和T215A发生突变时，不同病毒在小鼠体内表现高低不同的致病性[18]。本研究中，所有分离株的M1蛋白30位均为D，215位均为A，所以8株分离株在哺乳动物体内的致病性也应存在差异，具体差异情况还需要进一步研究。金刚烷类药物可以靶向于M2蛋白，进而起到抗流感作用[10]，S31N则是最常见的金刚烷抗性标记[19]。XD1~XD7的M2蛋白第31位氨基酸存在S转变为N的变异，表明均具有金刚烷胺类药物的抗性[19]；而XD8在31位氨基酸为S，显示对金刚烷胺类药物敏感。4结论综上所述，本研究分离出8株禽源的H9N2亚型AIV，并对病毒的M基因进行全长扩增及基因序列分析。结果显示，XD1~XD7分离株M基因属于G1-like分支，XD8分离株M基因属于BJ94-like分支。XD1~XD7分离株显示金刚烷胺类药物抗性，并发生增加病毒感染性的突变，而XD8则显示对金刚烷胺类药物敏感。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.003.F003