氧化应激是造成动物规模化养殖巨大经济损失的主要原因之一，是由机体活性氧成分与抗氧化系统之间平衡失调引起的一系列适应性的反应。活性氧会导致细胞毒性作用，造成蛋白质和DNA损伤。在动物规模化养殖中，由环境和饲养因素等均可引起动物产生应激反应，造成动物生长发育迟缓、采食量下降、精神不佳、免疫力下降，使其易遭病菌侵袭，甚至引起大规模动物死亡[1]。因此，畜牧生产研究中常在日粮中添加抗氧化剂，以此达到提高动物的抗氧化能力的目的。鸡血藤又名血风藤、红藤、活血藤、大血藤等，药用部位为豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤茎[2]，因采收时割断有赤如鸡血的汁液渗出而得名。我国广西、云南、广东、贵州等地区的鸡血藤资源非常丰富[3]。鸡血藤的主要活性成分为黄酮类化合物，具有影响造血系统、抗血小板聚集、调节脂质代谢，抗心肌缺血及脑缺血、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化、调节酪氨酸酶活性等药理作用[4]。Liao等[5]研究发现，鸡血藤的氧化自由基吸收能力（ORAC）值在所研究的45种活血化瘀中药中活性最高。谢学明等[6]研究发现，5 g/L的鸡血藤对DPPH的抑制率与0.01 g/L的维生素C（VC）相当，表明鸡血藤黄酮的强抗氧化活性使其在减轻氧化应激方面具有巨大的应用潜能。本试验采用乙醇提取法从鸡血藤中提取鸡血藤总黄酮，分析ROS和NO水平，研究鸡血藤总黄酮对过氧化氢（H2O2）诱导RAW264.7细胞氧化应激的调节作用，为鸡血藤的临床运用提供参考。1材料与方法1.1试验材料鸡血藤饮片购自广西南宁市中药材市场，原产地为广西崇左市，经广西大学动物科学技术学院药理实验室鉴定为真品。小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞所。主要试剂：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）、亚硝酸钠（NaNO2）、萘乙烯二胺和对氨基苯磺酸购自Sigma公司。胎牛血清（FBS）、DMEM培养液与青链霉素混合溶液（PS）购自Gibco公司。过氧化氢和乙醇均购自成都科龙化工试剂厂。主要仪器：AB104-L电子分析天平（梅特勒—托利多公司）、3K-15台式高速冷冻离心机（Sigma公司）、Q5UV超纯水仪（Millipore公司产品）、Multimode Plate Reader多功能酶标仪（Perkin Elmer公司）、FD-1冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）、RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。1.2试验方法1.2.1鸡血藤总黄酮的制备鸡血藤饮片粉碎成中细粉，然后采用乙醇提取法，以50%的乙醇溶液为溶剂，按1∶30的比例进行提取，提取温度为80 ℃，时间设置为3 h。提取液过滤、浓缩、初步纯化，然后旋转蒸发去除乙醇，通过冷冻干燥获得的产物即为鸡血藤总黄酮。以芦丁为标准品，经紫外分光光度法检测，黄酮含量为58.00%。1.2.2鸡血藤总黄酮对过氧化氢刺激RAW264.7细胞活性的影响将浓度为5×105/mL的RAW264.7细胞接种于96孔板中，每孔100 μL。并在37 ℃、5% CO2条件下培养过夜，弃去培养液，每孔加入100 μL用完全培养基稀释的低（25 mg/L）、中（50 mg/L）、高浓度（100 mg/L）的鸡血藤总黄酮提取液。并设置空白对照组和H2O2模型组。孵育2 h后，弃上清，每孔加入10 μL H2O2使其终浓度为250 μmol/L，继续培养12 h后，弃去含H2O2的培养液，加入90 μL培养液和10 μL 5 g/L的MTT储存液。37 ℃孵育4 h，每孔加入100 μL MTT结晶溶解液（10% SDS，10 mmol/L HCl），并在37 ℃下孵育过夜，用多功能酶标仪检测OD595，计算细胞相对活性。细胞活性=OD样品-OD空白OD对照-OD空白×100% （1）1.2.3鸡血藤总黄酮对过氧化氢刺激RAW264.7细胞ROS、NO水平的影响RAW264.7细胞以5×105/mL的浓度接种于四周黑色板底透明的96孔板中，每孔100 μL。37 ℃、5% CO2培养过夜，弃去培养液，每孔加入100 μL用完全培养基稀释的低、中、高浓度的鸡血藤总黄酮提取液，并设置空白对照组和H2O2模型组。继续培养2 h，弃上清，每孔加入10 μL H2O2使其终浓度为250 μmol/L，继续培养12 h，检测上清中NO浓度以及细胞中ROS水平。1.2.3.1NO的检测新配1 mmol/L NaNO2储存液稀释为100、80、60、40、20 μmol/L及0的标准稀释液，各取100 μL标准稀释液按照1∶1加入Griess试剂（等体积混合的0.1%萘乙烯二胺和1%对氨基苯磺酸）混匀，室温避光反应10 min，用多功能酶标仪检测OD550，以NaNO2浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。同理，取100 μL细胞上清液，按上述方法测定OD550，并根据标准曲线计算NO含量。1.2.3.2ROS的检测弃去培养液，使用PBS洗涤细胞3次，每孔加入50 μL 10 μmol/L的DCFH-DA荧光探针，37 ℃、5%CO2条件下孵育30 min，每隔10 min摇匀一次。孵育结束后，弃上清，用PBS洗涤3次，使用多功能酶标仪在激发波长488 nm和发射波长525 nm处检测荧光信号强度。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 22软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1鸡血藤总黄酮对H2O2刺激RAW264.7细胞活性的影响（见图1）由图1可知，与对照组相比，H2O2模型组RAW264.7细胞活性显著降低（P0.05），表明250 μmol/L的H2O2对RAW264.7细胞的生长增殖具有显著抑制作用。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.003.F001图1鸡血藤总黄酮对H2O2刺激RAW264.7细胞活性的影响Fig.1Effect of total flavonoids of Spatholobus suberectus Dunn on the activity of hydrogen peroxide-stimulated RAW cells注 ： 不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。25、50和100 mg/L的鸡血藤总黄酮预处理均可抑制H2O2对RAW264.7细胞活性的影响，且细胞活性随着药物浓度增加而增加。鸡血藤总黄酮浓度为50、100 mg/L时，细胞活性显著高于H2O2模型组（P0.05），表明鸡血藤总黄酮预处理对H2O2诱导的氧化应激具有一定抑制作用。2.2鸡血藤总黄酮对H2O2刺激RAW264.7细胞ROS、NO水平的影响2.2.1鸡血藤总黄酮对H2O2刺激RAW264.7细胞ROS水平的影响（见图2）由图2可知，与空白对照组相比，H2O2模型组细胞的ROS水平显著升高（P0.05），表明250 μmol/L的H2O2可引起RAW264.7细胞内自由基含量大量产生，进而引起氧化应激反应。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.003.F002图2鸡血藤总黄酮对H2O2刺激RAW264.7细胞ROS水平的影响Fig.2Effect of total flavonoids of Spatholobus suberectus Dunn on ROS levels in hydrogen peroxide-stimulated RAW cells不同浓度鸡血藤总黄酮预处理均可抑制H2O2引起的ROS水平升高，当鸡血藤总黄酮浓度为50和100 mg/L时，ROS水平显著低于H2O2模型组（P0.05），表明鸡血藤总黄酮可有效抑制H2O2诱导的ROS产生。当鸡血藤总黄酮浓度为100 mg/L时，ROS水平与空白对照组差异不显著（P0.05），表明该浓度鸡血藤总黄酮的效果最好，可使ROS水平恢复接近正常值。2.2.2鸡血藤总黄酮对H2O2刺激RAW264.7细胞NO水平的影响（见图3）由图3可知，H2O2刺激引起细胞NO分泌水平显著升高（P0.05），表明H2O2引起了氧化应激反应。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.003.F003图3鸡血藤总黄酮对H2O2刺激RAW264.7细胞NO水平的影响Fig.3Effect of total flavonoids of Spatholobus suberectus Dunn on NO levels in hydrogen peroxide-stimulated RAW cells与H2O2模型组相比，经过不同浓度鸡血藤总黄酮处理后，细胞NO水平显著下降（P0.05），表明不同浓度的鸡血藤总黄酮对H2O2刺激细胞的NO分泌均具有显著的调节作用。3讨论氧化应激可导致组织和细胞发生氧化损伤。在动物大规模饲养中，氧化应激常导致饲养动物采食量下降、增重减缓、精神萎靡不振、免疫力降低，严重影响动物身体健康和饲养效益[7]。如何提高动物抗氧化应激能力、开发安全有效的抗氧化剂一直是国内、外的研究热点。ROS和RNS的含量是实验室检测是否发生氧化应激的常见指标。ROS是一类需氧细胞代谢过程中产生的氧衍生分子，是生物体内活性氧化合物的总称，包括超氧阴离子、羟自由基、H2O2、单线态氧等[8]。本研究所检测的NO是ROS自由基的一种，在正常生理作用下可调控血管伸缩，进而调节血压、作为细胞外第一信使对机体活动产生影响、发挥免疫效应调节免疫功能[9]。当动物处在氧化应激状态下，体内ROS、NO水平迅速上升，大量含有不成对电子的ROS极易与生物分子（如蛋白质、DNA等）发生反应，使蛋白质氧化与核酸裂解，对组织细胞活性和功能造成广泛损害[10]；大量NO在机体内蓄积可刺激活性氧自由基诱发脂质过氧化，造成机体损伤。因此，机体氧化应激的程度可通过检测ROS和NO水平直接反映。日常规模化饲养中，在一些外界不利因素影响下，如饲料配方改变、饲养环境条件突变、疫苗刺激、炎症感染等，机体高活性分子（如ROS和RNS）过量产生，机体清除ROS、RNS能力下降，抑制免疫系统正常反应，影响动物的生长和生产性能，不但增加生产成本，还降低了饲养效益。研究发现，在氧化应激状态下，适量添加茶多酚可缓解应激对仔猪生长性能和免疫功能的抑制，减轻应激对组织结构的损伤程度[11]。在热应激的状态下，适量添加姜黄素可有效抑制肉鸡受热应激引起的组织细胞损伤，减缓肉鸡生长性能下降[12]。因此，规模化养殖中常通过添加抗氧化物降低氧化应激对动物的损伤，提高动物的生长性能。H2O2是一种重要的活性氧分子，在机体细胞代谢的多个环节中均可产生，主要起到伤口消毒、刺激细胞繁殖、传导细胞内信号的作用。有研究发现，随着H2O2浓度增加，可引起肠上皮细胞线粒体明显损伤，改变线粒体的结构和功能，与细胞凋亡的发生密切相关[13]。H2O2因其成本较低、性质相对稳定、易获得，已成为现代研究细胞氧化损伤的重要工具。本试验首先采用MTT法研究鸡血藤总黄酮对受H2O2刺激的RAW264.7细胞活性的影响，结果显示，随着鸡血藤总黄酮药物浓度增加，细胞活性呈上升趋势；当鸡血藤总黄酮浓度为50、100 mg/L时，试验组细胞活性显著大于H2O2模型组，表明鸡血藤总黄酮预处理可减少由H2O2诱导产生的氧化应激作用。之后通过检测细胞ROS、NO水平研究鸡血藤总黄酮对H2O2刺激RAW264.7细胞的调节作用。结果显示，H2O2刺激RAW264.7细胞后，NO和ROS水平显著上升，表明氧化应激反应产生；与H2O2模型组相比，经不同浓度鸡血藤总黄酮处理后，细胞ROS和NO水平逐渐下降，当鸡血藤总黄酮浓度为50、100 mg/L时可有效抑制由H2O2诱导的ROS和NO的产生。结果表明，鸡血藤总黄酮对受H2O2刺激RAW264.7细胞具有显著的调节作用，改善了H2O2刺激RAW264.7细胞引起的氧化应激损伤，结果与汪娟等[14]研究结果一致，也与一些研究鸡血藤提取物发挥抗氧化作用的报道一致。如鸡血藤乙醇提取物以浓度依赖性方式抑制H2O2诱导的大鼠红细胞氧化溶血，并通过清除OH·、O2-及H2O2发挥抗氧化作用[15]；鸡血藤总黄酮提取液对Fenton体系产生的OH·具有很好的清除作用[16]。4结论本研究结果显示，当鸡血藤总黄酮浓度为50和100 mg/L时，细胞ROS、NO水平显著低于H2O2模型组，表明鸡血藤总黄酮可有效抑制由H2O2诱导的ROS产生和NO分泌，缓解H2O2刺激RAW264.7细胞的氧化应激损伤，具有一定的保护作用。