在黑龙江农垦区域的科研与养殖生产业中，高水分玉米籽实湿贮技术的研究与应用已延续近五十年的历史[1-3]。玉米籽实湿贮技术可减少传统烘晒环节3%~5%储存损失，节约干燥能源，降低贮藏费用，还能够抑菌、防霉变，减少营养物质损失。湿贮玉米在牧场中的应用尚且停留在依据化学营养成分评估结合传统经验的现状，受到不同地区玉米的种植环境、气候因素以及人工制作方式和储存方式等外界因素制约，导致不同地区、牧场的湿贮玉米品质及应用效果存在差异。全面评估湿贮玉米的营养品质及饲喂价值，方可更科学准确地指导牧场充分发挥湿贮玉米的营养和经济价值，提高养殖经济效益[4-6]。体外发酵培养试验是通过采集反刍动物瘤胃液，利用体外发酵装置进行的体外仿生试验。通过体外发酵培养可测定多种瘤胃发酵参数，模拟营养物质的消化测定饲料样品含有的营养素水平，具有操作简单、易掌握、费用低且试验条件易模拟、实用性强等特点，广泛应用于反刍家畜饲料原料营养价值评估[7-9]。本试验对来自同一地区的6个牧场的湿贮玉米开展了体外发酵的pH值、总产气量（GP）、菌体蛋白（BCP）等代谢参数的测定，以期为湿贮玉米在牧场的科学精准利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所使用的材料、仪器、试剂均参考前期进行的湿贮玉米体外发酵粗蛋白、干物质及中性洗涤纤维降解率试验[10]。试验用仪器均由黑龙江八一农垦大学动物科技学院提供，试剂由黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室提供。1.2试验方法1.2.1样品处理样品处理方法参照前期进行湿贮玉米体外发酵粗蛋白、干物质及中性洗涤纤维降解率试验[10]中的方法。1.2.2瘤胃液采集与体外批次培养装置及处理方法参照前期试验中的操作[10]。1.2.3缓冲液的配制缓冲液制备参照任莹等[9]方法。1.3测定指标及方法将发酵12 h后的培养瓶中的缓冲液瘤胃液及消化后的底物残渣倒出，用四层纱布过滤，分离滤渣置于干净的铝盒中称重后放入恒温烘干箱中100 ℃烘干24 h，过滤后的滤液装入离心管中，4 000 r/min离心15 min。1.3.1pH值及BCP含量采用pH计测定刚采集的瘤胃液pH和体外发酵12 h的pH值。用40~60 μm的尼龙布过滤羊瘤胃液后，低速离心15 min，去除瘤胃液中不易降解的大颗粒饲料和少数原生动物。准确测定上清20 mL，4 ℃ 16 000 r/min离心20 min。去除上清液，用生理盐水反复洗涤沉淀，经过两次洗涤即得到细菌组分。BCP测定参照Cotta等[7]和Broderick等[8]的方法。经差速离心后，将细菌沉淀装入洁净的消化管中，并分别在消化管中加入0.25 g硫酸铜、2.25 g硫酸钾等催化剂以及10 mL浓硫酸反应物。将消化管放入消煮炉中，410 ℃消煮2 h，消化管冷却后，按照凯氏微量定氮法常规测定BCP的含量。因本试验测定的是氮含量，折算蛋白含量系数按6.27计算[11]。1.3.2GP及产气速率分别记录体外发酵的2、4、6、8、10、12 h的玻璃注射器的读数为累计GP，若GP超过30 mL后将气体排出并记录。根据GP计算产气速率。产气速率=（某时间段终点GP-某时间段起点GP）/该时间段时长（1）1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS.23软件进行单因素方差分析（One -way ANOVA），pH值、GP数据采用Duncan's法进行多重比较，BCP数据采用Dunnett T3法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同牧场湿贮玉米体外发酵pH值和BCP含量（见表1）采集的瘤胃液pH值为6.66，在正常范围（5.5~7.0）内[12]，可用于体外发酵试验。由表1可知，经过12 h的体外发酵，各组pH值均呈不同程度的降低，由高到低排序是523641，数值均在4.70~5.51之间；1号牧场湿贮玉米的pH值显著低于4号与5号（P0.05）。不同牧场湿贮玉米体外发酵BCP含量由高到低排序为：3=46521，均在4.20~9.22 g/L之间；3号、4号、5号、6号牧场湿贮玉米体外发酵BCP含量极显著高于1号（P0.01）；3号、4号牧场湿贮玉米体外发酵BCP含量均显著高于2号（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.006.T001表1不同牧场湿贮玉米体外发酵pH值和BCP含量Tab.1In vitro fermentation pH value and BCP content of wet stored corn in different pastures组别pH值BCP/(g/L）1号4.70±0.13b4.20±0.21Bc2号5.18±0.13ab6.65±0.36ABb3号5.12±0.20ab9.22±0.74Aa4号4.77±0.18b9.22±1.21Aa5号5.51±0.30a7.90±0.49Aab6号5.03±20.52ab8.15±1.34Aab注 ：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2不同牧场湿贮玉米体外发酵GP及产气速率（见表2、表3）由表2可知，发酵2~4 h时，2号样品GP极显著高于其他样品（P0.01）；6 h时，3号样品极显著高于其他样品（P0.01）；8 h时，1号样品极显著高于2号、4号、5号样品（P0.01），显著高于6号（P0.05）；10~12 h，1号样品极显著高于其他样品（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.006.T002表2不同牧场湿贮玉米体外发酵GPTab.2In vitro fermentation GP of wet stored corn in different pastures组别2 h4 h6 h8 h10 h12 h平均值16.50±10.4023.10±7.8047.90±12.5068.60±16.2080.30±18.2090.20±17.801号4.50±0.14De15.40±0.93Dd47.40±1.65Bc82.10±1.84Aa104.50±1.79Aa115.20±1.42Aa2号31.30±0.94Aa36.80±0.73Aa52.30±0.99Bb71.50±1.64Bc78.60±0.57Cd88.30±1.48Cc3号22.20±0.62Bb25.30±0.45Bb63.70±1.44Aa80.90±0.99Aa90.80±1.37Bb99.20±1.22Bb4号22.50±0.94Bb20.20±1.44Cc47.50±1.42Bc61.40±1.51Cd70.30±2.10De77.50±1.73Dd5号10.30±1.07Cc16.60±0.80CDd25.60±0.94Cd39.30±1.65De51.60±1.16Ef64.30±1.61Ee6号7.90±0.75Cd24.10±2.22Bb51.00±2.30Bb76.30±2.93ABb86.10±3.01Cc96.70±2.58BbmL由表3可知，体外发酵的前4 h内，各样品产气缓慢，速率为5.77 mL/h；4~8 h速率迅速增加，达到11.38 mL/h；随着培养时间推移，8 h后各样品湿贮产气速率变慢，仅有5.40 mL/h。其中1号牧场样品体外发酵4 h内产气速率最低，4~8 h提升4.33倍，8 h后产气增速变缓，但仍反超其他各组达50%以上；2号样品呈现8 h前持续高速发酵产气，而后减半速率发酵的规律。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.006.T003表3不同牧场湿贮玉米体外发酵在不同阶段产气速率Tab.3In vitro fermentation gas production rate of wet stored corn in different stages组别4 h之前4~8 h8 h之后平均值5.7711.385.401号3.8516.688.282号9.208.684.203号6.3313.904.584号5.0510.304.035号4.155.686.256号6.0313.055.10mL/h3讨论pH值是评价瘤胃功能及日粮组分和营养成分的发酵效果重要的综合指标之一[13-14]。嘎尔迪等[15]研究表明，颗粒玉米、烘烤玉米和蒸气玉米发酵后羊瘤胃液pH值变动范围分别为5.92~6.36、6.08~6.47以及5.93~6.30。彭述宇等[16]研究表明，常规玉米与湿贮玉米不同比例组合48 h体外发酵pH值维持在5.66~5.85。本试验中，发酵后所有样品的pH值在4.70~5.51之间，结果偏低，与刘文娟等[17]湿玉米纤维饲料试验结果相仿。主要原因在于本试验采用使用的是纯湿贮玉米，且为发酵12 h结果，提示使用湿贮玉米时要充分考虑其发酵过程中pH值的变化规律，合理搭配其他蛋白原料及粗饲料。瘤胃代谢产生的BCP是反刍动物机体氮的主要来源之一，可以满足反刍动物所需蛋白的40%~70%[18]，也是评价饲料原料及日粮营养水平的重要指标。任莹等[9]对花生藤、木薯渣和甜叶菊渣等瘤胃代谢研究表明，其细菌氮含量在1.48~1.59 mol/(g·mL)。刘彩娟等[19]、朱继红等[20]研究表明，高剂量添加复合益生菌可以显著增加瘤胃液BCP的浓度。目前，国内有关针对湿贮籽实玉米的体外代谢BCP含量尚未见报道。本试验中，各牧场样品BCP含量变异度较大，在4.20~9.22 g/L之间，原因可能是原料来源的差异，有待进一步研究。GP综合反映了饲料本身的降解特性和微生物生长的情况，是评价体外发酵效果的重要指标之一[9,21]。嘎尔迪等[15]、陈涛[22]、辛杭书等[23]研究表明，蒸汽压片玉米日粮组体外发酵GP显著高于普通玉米日粮组，且GP高峰值出现在发酵后48 h。彭述宇等[16]研究表明，将常规玉米与湿贮玉米按照不同比例组合，48 h内GP随着湿贮玉米组合比例的增加呈先增后减的变化，不同比例组合间差异显著。本试验中，GP在0~4 h和8~12 h期间速率较低，4~8 h期间明显提高；发酵12 h GP达90.2 mL。李亚君等[24]研究中常规玉米12 h GP只有30 mL，表明湿贮玉米较常规玉米的瘤胃发酵更快。4结论为实现高水分湿贮玉米的科学高效利用，既要关注常规化学营养成分指标，更要结合体外发酵方法或动物代谢方法测定瘤胃各代谢参数的指标。本研究结果表明，同一地区的6个不同牧场湿贮玉米体外发酵pH值差异不显著，但GP和BCP含量差异极显著。体外发酵的前4 h内，各样品产气缓慢，速率为5.77 mL/h；4~8 h速率迅速增加，达到11.38 mL/h；8 h后各样品产气速率变慢，仅5.40 mL/h。