副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）属于巴氏杆菌科、嗜血杆菌属，是革拉瑟氏病的病原菌，该病的发病率、致死率均较高。Hps对抗生素适应快，可很快产生耐药性，甚至发病初期使用的抗生素在流行后期即可发生耐药性，导致动物性食品中抗生素残留超标，极易引发食品安全和公共卫生事件，严重危害广大民众的身心健康[1]。茶多酚（tea polyphenol，TP）是茶叶中酚类及酚类物质衍生物的总称，茶叶中提取的TP是一种天然的抗氧化剂，具有较好的抗菌、抗氧化、抗肿瘤等功效，可作为替抗产品以减少抗生素的使用[2]。牛知慧等[3]研究报道，TP对多种食品致病菌均具有抑制作用。华德兴[2]研究表明，绿茶及提取物增强了β-内酰胺类抗生素和四环素对MRSA的抗菌效果，且具有协同作用。但不同种类茶叶提取物TP，其抑菌活性以及对细菌细胞的影响并不相同[4]。我国南北方气候、生活习惯等差异较大，北方以生产红茶为主。本研究观察红茶提取物TP对Hps体外生长及小鼠感染Hps的影响，研究TP对Hps的抑菌性能，探讨TP对抗Hps感染的作用，并研究TP对Hps细胞膜渗透性的影响，为红茶提取物TP的临床应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株Hps河南分离毒株由河南科技学院兽医微生物学实验室分离、鉴定、保存。1.1.2试验动物KM小鼠，雌性，体重18~20 g，购自新乡医学院实验动物研究中心，自由采食、饮水。1.1.3试验试剂TP（98%）购自陕西天宇康泽生物科技有限公司，TSA培养基、TSB培养基购自新乡市红旗区扬帆化玻仪器商行，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）购自新乡市博思智宝化玻营销部，犊牛血清购自新乡市泰博智宝化玻营销部。1.1.4试验仪器YX280B立式压力蒸汽灭菌器（浙江爱仕达股份有限公司）、JH-150-I隔水式恒温培养箱（上海精密仪器设备有限公司）、HALO DB-20紫外分光光度计（Dynamica）、HDL洁净工作台（北京东联哈尔仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1河南分离野毒株Hps的复苏培养将冻存的河南分离毒株Hps接种于含犊牛血清和NAD的TSA平板上培养24~48 h，取菌落再接种重复上述操作于TSA培养基中培养24~48 h，PBS洗涤菌落并充分混匀，10倍系列稀释（浓度分别为：8.96×108、4.48×109、2.24×1010、1.12×1011 CFU/mL）。1.2.2河南分离野毒株Hps半数致死剂量（LD50）试验动物KM小鼠20只随机分为5组，每组4只。取1.2.1中制得Hps菌液分别对各试验组KM小鼠每只进行腹腔接种（0.4 mL/只），各试验组小鼠接种剂量分别为1.12×1011、2.24×1010、4.48×109、8.96×108 CFU/mL，对照组小鼠接种等剂量无菌PBS液。接种后观察、记录试验KM小鼠的发病及死亡情况，试验期1周。剖检试验过程中死亡KM小鼠，无菌采集内脏组织进行细菌分离鉴定，并根据Reed-Muench法计算小鼠LD50[1]。1.2.3茶多酚最小抑菌浓度（MIC）采用体外试管法测定红茶提取物TP的抑菌活性。采用PBS做稀释液，将TP配制成浓度为100 g/L储存液，按比例加入含NAD的TSB液体培养基，稀释至液体培养基中含TP浓度分别为14.0、12.0、11.0、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0 g/L。将细菌新鲜培养液以终浓度为4.48×109 CFU/mL接种于含TP新生牛血清和NAD的TSB液体培养基37 ℃，200 r/min培养16 h，观察Hps的生长情况，TSB培养基中透明澄清时所对应的药液浓度即为MIC，试验重复3次[2-3]。1.2.4茶多酚对小鼠感染Hps的保护试验将20只小鼠随机分为5组，每组4只。其中3个试验组小鼠分别灌服3、30、300 μL/kg的TP溶液，阳性对照组和空白对照组小鼠均灌服无菌PBS液；4 h后，3个试验组和阳性对照组小鼠腹腔注射浓度为1.12×1011 CFU/mL的Hps菌液0.4 mL/kg，对照组小鼠腹腔注射无菌PBS液0.4 mL。临床连续观察7 d，记录试验KM小鼠的临床症状；死亡的试验KM小鼠立即剖解，接种Hps未死亡KM小鼠在7 d进行解剖，记录剖检结果。1.2.5细胞膜渗透性试验将河南分离毒株Hps接种于TSB培养基，200 r/min过夜培养，采用平板计数法计数，使细菌浓度达1.12×109 CFU/mL，培养液12000 r/min离心，弃上清，沉淀用0.5% NaCl溶液洗涤、重悬3次[3]。将其分成4份，分别加入3种不同浓度的茶多酚（0.5 MIC、1 MIC、2 MIC），空白对照组加入等体积的0.5% NaCl，37 ℃培养8 h，离心，取上清，600 nm下测量紫外分光光度值，试验重复3次。2结果与分析2.1河南分离野毒株Hps LD50的测定结果（见表1、图1、图2）由表1可知，感染Hps后20 min，小鼠开始出现震颤、扎堆；感染后40 min，小鼠精神沉郁、卧地不起；感染4 h后，试验2组小鼠死亡1只（1/4），试验3组死亡1只小鼠（1/4），试验4组于感染4、6 h时各死亡一只小鼠；试验1组组无小鼠死亡，和对照组无小鼠死亡。根据数据计算，LD50约为1.12×1011。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.005.T001表1河南分离野毒株Hps对小鼠的毒力测定Tab.1Determination of virulence of Hps in mice组别菌液浓度/(CFU/mL)小鼠总数/只死亡小鼠/只对照组040试验1组8.96×10840试验2组4.48×10941试验3组2.24×101041试验4组1.12×101142由图1可知，感染组小鼠震颤、扎堆；沉郁、卧地不起，呼吸加快、站立不稳，部分小组出现死亡情况。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.005.F001图1小鼠感染Hps症状Fig.1Symptoms of Hps infection in mice小鼠感染Hps剖检结果见图2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.005.F002图2小鼠感染Hps剖解图Fig.2Anatomical map of Hps infection in mice由图2可知，小鼠胸腔内有积液，肺脏有出血点，胸腔有黑色血凝块，腹腔轻微粘连，其他脏器无明显变化。2.2TP对Hps的MIC测定结果试验结果显示，添加TP 10 g/L以及其以上浓度的TSB培养基中透明澄清且无细菌生长。因此，10 g/L为其最小抑菌浓度。2.3TP对KM小鼠Hps感染的保护试验结果结果显示，试验1组、试验2组小鼠于注射40 min左右出现精神萎靡，食欲不振，两组小鼠均于注射后各死亡2只；死亡时间不规律，但均在4.0~7.5 h左右死亡。阳性对照组小鼠于注射35~40 min左右出现精神萎靡、食欲不振等情况，在攻毒后4.0~6.5 h期间死亡2只。试验3组和空白对照组小鼠无死亡。剖检死亡小鼠，发现小鼠腹腔和胸腔内有积液，肝脏、心脏、脾脏和淋巴系膜等组织器官出现出血现象，从病变组织可分离到Hps。结果表明，高剂量TP对Hps感染可提供一定的保护作用。2.4细胞膜渗透性试验结果（见表2）由表2可知，随着TP添加量不断增加，600 nm处吸光值也呈升高趋势。结果表明，TP能够改变Hps细胞膜的通透性，导致Hps细菌细胞内物质向外渗透。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.005.T002表2细胞膜渗透性试验结果Tab.2Cell membrane permeability test results项目空白对照组0.5 MIC组1 MIC组2 MIC组吸光值0.044 20.099 10.083 50.092 93讨论随着畜牧养殖业快速发展，使用抗生素导致细菌产生耐药性以及耐药菌株增多等问题逐渐凸显，寻找可减少或取代抗生素的绿色、无毒、无副作用的抗菌物质成为研究热点方向。TP来自自然茶叶，无毒、无副作用，且经证实对多种细菌具有显著的抑制作用[2,5-6]。刘唤明等[7]研究报道，TP的抑菌谱较广，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有明显抑制作用。作为一种新型天然防腐剂，TP已在副溶血弧菌的控制方面显示出良好的抗菌效果。但目前研究多集中于TP在畜禽养殖业中的应用[8-10]，关于TP对Hps的抗菌活性及防治效果的研究尚未见报道。本试验研究了TP对临床分离毒株Hps的抑菌效果及对Hps细胞膜渗透性的影响。结果显示，TP对Hps具有明显的抑制作用。本试验测定的河南分离株Hps对小鼠的LD50为1.12×1011，与高鹏程[11]报道的Hps对KM小鼠出现致死剂量为2×109，且致死不规律不一致，分析Hps不同菌株之间毒力强弱有差异，对动物的LD50也有差异。在预试验中曾筛选使用8.96×108及4.48×109 CFU/mL细菌接种浓度对TP的MIC值，发现随着细菌浓度升高，MIC值略升高。TP是茶叶中酚类物质的总称，由大约30多种含酚基的物质组成，包括黄烷醇类（儿茶素类）、黄酮醇类（黄酮醇及其苷类）等。其中儿茶素能够直接破坏生物的细胞膜，使致病菌无法与易感细胞结合[5,12]；并且TP中的儿茶素也具有阻止细菌聚集的能力，可阻止细菌生物膜形成，减弱了致病菌的致病性及抗性[13]。因此，推测茶叶提取物的抑菌作用与破坏细菌细胞膜并提高其渗透性具有一定的关联[11，14-15]。本试验进行了细胞膜渗透性研究，结果显示，随着茶叶提取物浓度增加，600 nm处的细菌渗透性物质逐渐增多。本试验结果为深入研究茶叶提取物的抑菌机制以及天然药物TP对Hps的抗菌活性提供了一定参考。4结论本研究结果表明，TP对Hps具有抑制作用，并且随着TP浓度增加，其抑菌效果越来越强。对细菌细胞膜渗透性的试验得出，TP抑制Hps的作用机制可能是TP改变了细菌细胞膜的通透性，从而起到抑制细菌的作用。本研究结论可为今后TP作为新型药物开发提供参考。