β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯（阿朴酯）是一种高效的类胡萝卜素添加剂，与其他着色剂叶黄素[1]、万寿菊提取物[2]和角黄素[3-4]等功能类似，常应用于饲料工业中，对禽类皮肤、脚胫、皮下脂肪、蛋黄的着色具有显著效果[5-7]，是我国允许使用的禽饲料添加剂。阿朴酯与斑蝥黄配伍使用能够显著增加肉鸡皮肤色素沉积[8]，改善蛋黄着色和色素沉积[9]，与辣椒红、β-阿朴-8'-胡萝卜素醛、斑蝥黄或叶黄素配合使用时总量不超过80 mg/kg。因此，快速精准检测阿朴酯的含量成为饲料行业关注的问题。目前，饲料和食品中斑蝥黄、β-阿朴-8'-胡萝卜素醛检测方法主要有高效液相色谱法[10-15]和分光光度法[16]。关于阿朴酯检测方法的研究较少，栾庆祥等[17-18]采用超高效液相色谱法检测鸡蛋中阿朴酯的含量。杨梅等[19]采用超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中阿朴酯的含量。章厉劼等[20]采用超高效液相色谱法测定饲料中阿朴酯和斑蝥黄的含量。本研究采用反相高效液相色谱法，对饲料中阿朴酯直接提取后上机进行检测，无须萃取净化，该方法操作简单、准确度高，试剂耗材易于获得，且采用常规液相易于推广应用，可有效帮助饲料中着色剂使用监测与评估，确保饲料质量安全。1材料与方法1.1仪器与试剂Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色谱仪、1260 MWD紫外检测器、离心机（蜀科科技有限责任公司）、Reeko AutoEVA全自动浓缩仪、HY-6双层调速振荡器、0.22 µm微孔有机滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯标准品（纯度≥98.6%，Carote Nature）；甲基叔丁基醚（色谱纯）、甲醇（色谱纯）；三氯甲烷、正己烷、环己烷（分析纯）。1.2标准溶液的配制1.2.140 µg/mL阿朴酯标准储备液转移阿朴酯1.0 mg于25 mL容量瓶中，加入4 mL甲基叔丁基醚溶解，使用甲醇定容，-18 ℃避光保存。1.2.2标准工作液移取适量储备液，使用甲基叔丁基醚-甲醇（15∶85）混合溶液逐级稀释，配制成0.04、0.10、0.20、1.00、2.00、10.0 µg/mL阿朴酯标准工作溶液进行高效液相色谱分析。上述操作均在通风橱内避光进行。1.3样品前处理1.3.1饲料样品前处理准确称取饲料样品2.0 g，精确至0.000 1 g于100 mL容量瓶管中，加入5 mL超纯水，涡旋混匀2 min；加入15 mL甲基叔丁基醚混匀，振荡10 min；加入适量甲醇，摇床振荡30 min；使用甲醇定容至100 mL，摇匀，静置；取5 mL上清液溶液于10 mL离心管于氮吹仪50 ℃吹干，准确移取1 mL甲基叔丁基醚-甲醇溶液（15∶85）复溶，过滤，上机测定。上述操作均在通风橱内避光进行。1.3.2添加剂样品前处理准确称取饲料样品0.050 g（精确至0.000 1 g）于100 mL棕色容量瓶中，加入5 mL超纯水，涡旋混匀2 min；加入15 mL甲基叔丁基醚，混匀，振荡10 min；加入适量甲醇，摇床振荡30 min；使用甲醇定容至100 mL，摇匀，静置；吸取5 mL上清液溶液于100 mL容量瓶中用甲基叔丁基醚-甲醇溶液（15∶85）定容，过滤，上机测定。上述操作均在通风橱内避光进行。1.4液相色谱条件色谱柱：C30柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温：35 ℃；流动相在线脱气，流动相甲基叔丁基醚-甲醇溶液（15∶85），流速1.0 mL/min；紫外检测器，检测波长466 nm；进样量50 µL；运行时间：20 min。2结果与分析2.1样品前处理条件的选择在生产过程中，阿朴酯通常会采用水溶性基质进行包被。为打开饲料中阿朴酯的包被层，需要将样品置于适量的水中进行溶解，使用提取液提取。色素的提取多采用正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚等正相溶剂单独与其他溶剂组合进行提取[10-15,17-20]。本研究比较了正己烷、三氯甲烷、环己烷、甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液、甲醇、甲醇-乙酸乙酯-正己烷的混合溶液6种溶液的提取效率，每种提取液做3个平行。不同提取液对阿朴酯回收率的影响见表1。由表1可知，三氯甲烷和甲基叔丁基醚-甲醇提取液的干扰较少、回收率高，但三氯甲烷为有毒有害水污染物质，且属于2B类致癌物不易购买。因此，选择甲基叔丁基醚-甲醇为提取液。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.T001表1不同提取液对阿朴酯回收率的影响（n=3）项目平均回收率RSD正己烷26.616.60三氯甲烷79.48.21环己烷21.123.50甲基叔丁基醚-甲醇（15∶85）92.84.13甲醇50.65.98甲醇-乙酸乙酯-正己烷（1∶1∶1）66.38.93%甲基叔丁基醚与甲醇的不同比例对阿朴酯回收率的影响见表2。由表2可知，当甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液中甲基叔丁基醚比例不小于15%时，回收率大于90%，能够满足阿朴酯的检测要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.T002表2甲基叔丁基醚与甲醇的不同比例对阿朴酯回收率的影响（n=3）甲基叔丁基醚∶甲醇平均回收率RSD10∶9075.94.2415∶8599.13.3420∶8098.43.5730∶70108.63.1540∶60108.51.4250∶5098.85.0170∶3099.94.45%不同比例的甲基叔丁基醚-甲醇提取液对其他色素提取效果的影响见表3。由表3可知，随着甲基叔丁基醚比例的增加，叶黄素、玉米黄质的峰面积逐渐降低。兼顾几种色素同时检测的方式，且考虑到甲基叔丁基醚挥发性强、毒性大、不易与水互溶等特性，甲基叔丁基醚的比例不宜过高，选择甲基叔丁基醚-甲醇溶液（15∶85）为提取液。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.T003表3不同比例的甲基叔丁基醚-甲醇提取液对其他色素提取效果的影响（n=3）甲基叔丁基醚∶甲醇叶黄素平均峰面积玉米黄质平均峰面积15∶8542.542.330∶7040.340.140∶6036.335.950∶5030.931.570∶3025.826.3mAU·s研究表明，本研究采用加入5 mL超纯水，涡旋混匀2 min；加入15 mL甲基叔丁基醚，混匀，振荡10 min；加入50~60 mL甲醇，摇床振荡30 min作为样品提取条件。2.2色谱柱及流动相的选择与C18相比，C30柱是在硅胶基质上键合了C30功能团的反相色谱柱，添加了固定相的疏水性，该产品对于类胡萝卜素等几何异构体的分离十分有效。本研究所使用的方法采用C30色谱柱能够很好地分离叶黄素、玉米黄质、斑蝥黄、阿朴酯等。叶黄素、玉米黄质、斑蝥黄、阿朴酯分离色谱结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.F001图1叶黄素、玉米黄质、斑蝥黄、阿朴酯分离色谱结果由图1可知，当甲基叔丁基醚∶甲醇比例为15∶85，柱温35 ℃时，各组分均能够很好地分离。2.3紫外吸收波长的选择阿朴酯在正己烷中最大吸收波长为466 nm，参考其他资料，波长分别采用449、452、466、472 nm对2.0 mg/L阿朴酯标准溶液进行测定，阿朴酯在不同波长下的吸收光谱见图2。由图2可知，各波长下阿朴酯的峰面积差异不大，兼顾其他3种色素本方法选用466 nm作为检测波长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.F002图2阿朴酯在不同波长下的吸收光谱2.4方法的线性相关性取不同浓度阿朴酯标准工作液进行HPLC测定，将其所得的峰面积与所对应的标准工作溶液浓度进行线性回归分析，以阿朴酯浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图3。由图3可知，在浓度为0.04~10.00 mg/L范围内，阿朴酯的色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归方程为y=478.965 16x+1.603 56，相关系数R2=0.999 98。阿朴酯标准溶液色谱结果见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.F003图3标准曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.F004图4阿朴酯标准溶液色谱结果（2.0 mg/L）2.5方法的检出限、定量限、准确度和精密度2.5.1方法的检出限、定量限取空白样品进行基质加标，以大于或等于3倍信噪比所对应的样品中阿朴酯浓度为检出限，以大于或等于10倍信噪比所对应的样品中阿朴酯浓度为定量限。得出检出限为0.15 mg/kg；定量限为0.4 mg/kg。空白饲料样品色谱结果见图5，添加0.4 mg/kg阿朴酯的饲料样品色谱结果见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.F005图5空白饲料样品色谱结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.F006图6添加0.4 mg/kg阿朴酯的饲料样品色谱结果（S/N=10.1）2.5.2方法的准确度与精密度（见表4、表5）在饲料空白样品中添加适量的阿朴酯标准溶液，分别使试样中阿朴酯添加量为0.4、1.0、10.0 mg/kg，每个水平做6个重复，根据测得量与理论添加量计算回收率和6个平行间的相对标准偏差（RSD）考察方法的准确度和精密度。由表4、表5可知，空白饲料中添加0.4、1.0、10.0 mg/kg阿朴酯的回收率分别为98.5%、99.8%、86.0%，RSD分别为2.63%、4.32%、4.24%，表明该方法的准确度和精密度较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.T004表4不同添加量阿朴酯的检测值和RSD（n=6）阿朴酯添加量/(mg/kg)检测值/(mg/kg)平均值/(mg/kg)RSD/%1234560.40.4060.3940.4000.3770.3850.4040.3942.871.00.9330.9970.9821.0340.9731.0670.9984.7310.08.2408.1908.5508.4709.1808.9808.5984.6610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.T005表5不同添加量阿朴酯的回收率和RSD（n=6）阿朴酯添加量/(mg/kg)回收率/%平均值/%RSD/%1234560.4101.498.499.994.196.3100.998.52.631.093.399.798.2103.497.3106.799.84.3210.082.481.985.584.791.889.886.04.242.6饲料及饲料添加剂样品中阿朴酯分析结果本试验从市场抽取了8个样品，包括配合饲料、饲料添加剂，采用本研究方法对样品中的阿朴酯进行检测，样品检测结果见表6。8个饲料产品中1、2为黄羽肉鸡料，4为脱温鸡料，3、6、7为猪料，8为10%天丽黄。由表6可知，测定值与配方设定值一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.026.T006表6饲料及饲料添加剂样品中阿朴酯分析结果（n=2）编号样品名称阿朴酯含量/(mg/kg)1饲料16.942饲料27.273饲料30.004饲料422.505饲料530.706饲料60.007饲料70.008饲料添加剂11.03×1053结论本研究建立了反相高效液相色谱法测定饲料及饲料添加剂中阿朴酯含量的分析方法，该方法在0.04~10 mg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.999 98。加标回收率范围在86.0%~99.8%，RSD范围在2.87%~4.73%，检出限为0.15 mg/kg，定量限为0.40 mg/kg。该方法前处理操作简单、灵敏度高、重现性好，其准确度和精密度均能满足实际应用的需要，适用于饲料中阿朴酯含量的检测。