在集约化养殖中，限位栏因具有简化管理、节约劳动成本等优点，广泛应用于妊娠母猪的饲养管理[1]。但这种模式会影响母猪福利，易增加妊娠母猪体内皮质醇含量，诱导机体应激反应[2]。本课题组前期研究发现，胚胎着床期间的限制应激使胚胎着床率显著下降15.0%，氧化应激是导致胚胎着床异常的主要原因[3]。氧化应激与胚胎重吸收、反复性胚胎丢失、子痫症、胎儿宫内发育受滞和胎儿死亡等妊娠相关疾病密切相关[4]。核因子红细胞系2相关因子2（Nrf2）作为调节抗氧化基因的关键转录因子，可通过Keap1/Nrf2-HO-1信号通路调节Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达，进而保护细胞免受氧化损伤[5]。但关于Nrf2/HO-1信号通路与妊娠之间的关系尚不明确。番茄红素（LYC）作为具有较强抗氧化活性的天然抗氧化剂，可有效改善母鸡卵巢氧化应激[6]，消除重铬酸钾诱导的雏鸡卵巢损伤[7]，缓解高温下肉鸡的热应激反应症状[8]。在母猪妊娠期和泌乳期间，饲料中添加50 mg/kg LYC可显著提高胎盘中抗氧化能力和免疫力，进而提高母猪的繁殖性能（出生活仔数显著增加12.4%，出生死胎数显著下降66.7%）[9]。但LYC是否能够通过改善着床期子宫内膜氧化应激水平，进而缓解限制应激所致的子宫内膜蜕膜化异常还需进一步探索。本试验拟从着床期孕鼠子宫内膜形态学结构、子宫局部氧化应激水平和免疫水平方面，综合评估LYC对限制应激孕鼠胚胎着床的缓解作用，为LYC在生猪养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1番茄红素溶液番茄红素粉末购自邯郸晨光生物科技有限公司，纯度为98.61%，使用时使用玉米油稀释至所需浓度。参考本课题组朱原[10]研究结果，本试验中番茄红素按照10 mg/kg（体重）剂量对孕鼠进行灌胃，灌胃容量为0.5 mL/只。1.2试验设计7周龄清洁级昆明系小鼠180只（雌鼠120只，雄鼠60只），购自华阜康公司（试验动物许可证号：SCXK（京）2019-0008），试验动物自由饮食、饮水，光照14 h/d。适应性饲养1周，经发情鉴定、与性成熟雄鼠自然交配、确定阴道栓后，记作妊娠第1 d。选取妊娠第1 d的120只孕鼠随机分为4组，分别为对照组、限制应激组（RS组）、玉米油+应激组（CRS组）、番茄红素+应激组（LRS组），每组3个重复，每个重复10只。参考Liu[11]的方法进行限制应激，将孕鼠置于50 mL离心管中进行4 h/d应激处理（限制应激组），限制应激处理在灌胃0.5 mL/只的LYC或玉米油2 h后进行[12]（玉米油+应激组和番茄红素+应激组），试验期5 d，即在胚胎着床期第5 d时取材血清和子宫组织。试验均遵循动物福利与伦理要求。1.3样品采集应激结束后，孕鼠称重，乙醚麻醉，眼球摘除取血，3 000 r/min离心20 min制备血清样本，-20 ℃保存。脱颈处死，剖开腹腔，剪取完整子宫组织，称重。一部分子宫组织置于4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色；另一部分子宫组织于-80 ℃保存，用于RNA提取及抗氧化指标测定。1.4测定指标及方法1.4.1血清激素含量按照试剂盒说明书，采用双抗体夹心ELISA法测定孕鼠血清去甲肾上腺素（NE）含量。试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。1.4.2胚胎着床数目应激结束后，孕鼠经尾静脉注射0.5 mL 0.5%台盼蓝溶液，2 min后脱颈致死，取出完整子宫组织，记录胚胎着床数目并拍照。1.4.3子宫器官指数按照公式（1）计算子宫器官指数。子宫器官指数=子宫鲜重/胚胎着床期第5 d孕鼠应激结束时体重×100%(1)1.4.4子宫组织形态学观察将固定好的子宫标本经梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋制成蜡块，连续切成5 μm石蜡切片，用于HE染色。染色后的子宫组织切片经显微照相系统成像，使用Image ProPlus 6.0软件测量子宫内膜、子宫腺及整个子宫切面的面积，计算子宫内膜面积（子宫腺面积）占子宫面积的比例，即子宫内膜（子宫腺）相对面积比例。1.4.5子宫组织抗氧化指标称取0.1 g解冻的子宫组织样品，加入0.9 mL预冷的生理盐水，在冰浴条件下匀浆，于4 ℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液即为10%组织匀浆，按照说明书方法检测子宫组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）。试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。1.4.6子宫局部炎性因子采用RNA提取试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）提取子宫组织总RNA，并反转录制备cDNA。以GAPDH作为内参基因，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测Nrf2、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（INF-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）转录水平。引物序列见表1，引物的碱基序列由苏州吉玛基因股份有限公司合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.022.T001表1引物序列基因名称序列（5'→3'）长度/bpGAPDHF：CTAAGGCCAACCGTGAAA；R：CAGAGCATACAGGGAC132Nrf2F：AAGCACAGCCAGCACATTCTC；R：GACCAGGACTCACGGGAACTT129TNF-αF：GGAACTGGCAGAAGAGGCACTC；R：GTAGACAGAAGAGCGTGGTGGC122INF-γF：CCATCGGCTGACCTAGAGAAGA；R：GCAGTGTGTAGCGTTCATTGTC119IL-2F：ACCCTTGCTAATCACTCCTCAC；R：GCTGTGCTTCCGCTGTAGAG150IL-4F：CCATATCCACGGATGCGACAA；R：TGGTGTTCTTCGTTGCTGTGAG128反应体系（20 μL）为：GoTaqqPCR Master Mix（2×）10 μL，模板cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，无酶水7.2 μL。采用2-ΔΔCt相对定量法计算基因相对表达量。1.5数据统计与分析采用SPSS 23.0软件进行统计分析，采用One-way ANOVA进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1番茄红素对限制应激孕鼠血清中去甲肾上腺素含量、胚胎着床数目和子宫器官指数的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，RS组孕鼠血清去甲肾上腺素含量增加11.32%（P0.01）；与RS组相比，LRS组孕鼠去甲肾上腺素含量降低10.00%（P0.01）。研究表明，番茄红素预处理能够显著降低限制应激着床期孕鼠血清中应激激素去甲肾上腺素含量，而作为溶剂对照的玉米油并不能缓解由应激所引起的应激激素含量增加的现象。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.022.T002表2番茄红素对限制应激孕鼠血清去甲肾上腺素含量、胚胎着床数目和子宫器官指数的影响组别去甲肾上腺素/(nmol/L)胚胎着床数目/个子宫器官指数/%对照组0.51±0.00Bb15.20±0.20Aa0.58±0.03AaRS组0.57±0.00Aa9.60±0.24Bb0.31±0.01BbCRS组0.56±0.00Aa10.00±0.57Bb0.33±0.01BbLRS组0.51±0.00Bb14.20±0.37Aa0.59±0.03Aa注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。由表2可知，与对照组相比，RS组孕鼠子宫内胚胎着床数目降低36.84%（P0.01），子宫器官指数显著降低45.83%（P0.01）。与RS组相比，LRS组孕鼠子宫内胚胎着床数目增加47.92%（P0.01），子宫器官指数升高86.36%（P0.01）。研究表明，限制应激可以降低孕鼠子宫内胚胎着床数目及子宫器官指数，而番茄红素预处理能够提升限制应激着床期孕鼠子宫内的胚胎着床数目及子宫器官指数。2.2番茄红素对限制应激孕鼠子宫组织形态学的影响（见图1）子宫作为孕育胎儿的重要器官，在低倍镜下观察，子宫横断面呈椭圆形，形状如倒置的梨形，由外向内分别为浆膜层、肌层及内膜层，子宫肌层包含外面的环形肌和里面的纵行肌。由图1可知，对照组子宫内膜较为疏松，在靠近子宫腔附近细胞的蜕膜化现象较明显，子宫腺变狭长。RS组子宫内膜的疏松化程度较低，子宫腔附近细胞蜕膜化现象不明显，子宫腺数量降低，子宫腺上皮细胞排列不规则且有空泡化现象，腺体分泌不足；番茄红素预处理后，LRS组子宫内膜疏松，在靠近子宫腔附近细胞出现明显蜕膜化，子宫腺数量增多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.022.F001图1番茄红素对限制应激孕鼠子宫组织形态的影响（400×）注：M为子宫肌层，UL为子宫腔，End为子宫内膜。2.3番茄红素对限制应激孕鼠子宫内膜和子宫腺相对面积比例的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，RS组孕鼠子宫内膜与子宫腺相对面积比例均极显著降低（P0.01）。与RS组相比，LRS组孕鼠子宫内膜与子宫腺面积比例分别增加20.22%、83.98%（P0.01）。研究表明，番茄红素预处理能够促进限制应激着床期孕鼠子宫内膜的蜕膜化进程，使子宫内膜和子宫腺发育趋于正常水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.022.T003表3番茄红素对限制应激孕鼠子宫内膜和子宫腺相对面积比例的影响组别子宫内膜相对面积比例子宫腺相对面积比例对照组55.10±1.83Aa2.16±0.05AaRS组47.64±1.40Bb1.15±0.09BbCRS组47.35±2.51Bb1.14±0.02BbLRS组57.27±1.43Aa2.12±0.03Aa%2.4番茄红素对限制应激孕鼠子宫局部抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，RS组子宫内膜组织SOD、GSH-Px活性分别降低9.68%、31.80%（P0.05），子宫T-AOC显著降低30.90%（P0.05），而脂质过氧化物MDA含量显著增加31.00%（P0.05）。与RS组相比，LRS组子宫内膜组织SOD、GSH-Px活性分别显著增加21.10%、82.60%（P0.01），子宫T-AOC显著增加64.50%（P0.01），而脂质过氧化物MDA含量显著降低65.60%（P0.01）。研究表明，番茄红素预处理能够显著降低限制应激着床期孕鼠子宫内的氧化应激水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.022.T004表4番茄红素对限制应激孕鼠子宫局部抗氧化指标的影响组别SOD/(U/mg prot)GSH-Px/(U/mg prot)T-AOC/(mol/g prot)MDA/(μmol/g prot)对照组61.36±1.27Bb29.94±1.92Bb0.11±0.01Bb0.97±0.07AbRS组55.42±0.73Bc20.41±1.63Bc0.07±0.01Bc1.27±0.00AaCRS组56.22±2.30Bc17.53±2.67Bc0.07±0.01Bc1.25±0.09AaLRS组67.11±1.35Aa37.27±2.49Aa0.12±0.01Aa0.44±0.06Bc2.4番茄红素对限制应激孕鼠子宫局部免疫mRNA表达量的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，RS组孕鼠子宫组织中核转录因子Nrf2 mRNA相对表达量显著下降52.88%（P0.01）。与RS组相比，LRS组孕鼠子宫组织中Nrf2 mRNA相对表达量显著增加113.60%（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.022.T005表5番茄红素对限制应激孕鼠子宫局部免疫mRNA的影响组别Nrf2 mRNATNF-α mRNAINF-γ mRNAIL-2 mRNAIL-4 mRNA对照组1.01±0.07Aa1.00±0.07ab1.03±0.14ab1.00±0.02a0.94±0.07BbRS组0.48±0.02Bbc1.11±0.05a1.10±0.11a0.50±0.05b1.52±0.04AaCRS组0.52±0.05Bb1.08±0.13ab0.94±0.11ab0.53±0.03b1.38±0.01AaLRS组1.02±0.02Aa0.90±0.02b0.76±0.04b0.94±0.06a0.95±0.02Bb与对照组相比，RS组孕鼠子宫组织中促炎因子IL-2 mRNA相对表达量显著下降49.65%（P0.01）。与RS组相比，LRS组子宫组织中IL-2 mRNA相对表达量显著增加85.75%（P0.05）。与对照组相比，RS组孕鼠子宫组织中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA相对表达量分别增加10.62%、6.49%、60.67%。与RS组相比，LRS组子宫组织中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA相对表达量分别下降18.32%、30.65%、37.15%（P0.05）。3讨论3.1番茄红素对限制应激孕鼠血清中去甲肾上腺素含量的影响应激信号通过激活下丘脑—垂体—肾上腺皮质系统和交感神经—肾上腺髓质系统，分泌皮质酮和儿茶酚胺类神经递质（肾上腺素和NE），从而将刺激信号转化为生物学信号进入机体发挥作用，因此NE可间接反映机体应激状态[13]。齐跃[14]研究发现，束缚应激可导致SD大鼠血浆NE水平明显升高，且含量与应激时长呈正相关。ICR孕鼠经历连续5 d束缚应激（4 h/d），血浆中NE含量显著增加29.49%[15]。本研究中，限制应激处理后孕鼠血清中去甲肾上腺素含量显著增加11.32%，表明试验成功构建妊娠小鼠限制应激模型；进一步用LYC预处理再进行限制应激后，血清中去甲肾上腺素含量显著降低10.00%。因此，LYC可通过降低NE水平缓解着床期孕鼠的应激反应。3.2番茄红素对限制应激着床期孕鼠子宫内膜发育和胚胎着床的影响胚胎成功床需要植入的囊胚与子宫内膜状态的双向互动。胚胎着床期间的应激不仅降低囊胚着床率，而且影响胎儿生长、子代出生体重。Liu等[11]研究发现，限制应激可导致E5孕鼠胚胎着床数目由11.3个降低至9.6个。赵立华[16]研究发现，E4孕鼠经历24 h急性束缚应激后，妊娠末期产仔数由9.6个降低至4.3个。刘红宇等[17]研究发现，慢性束缚应激处理后，E5孕鼠子宫内膜胚泡着床点数显著减少。朱原[10]研究发现，限制应激可导致E5孕鼠子宫和卵巢指数显著降低54.37%。研究表明，胚胎着床期间施以应激可显著降低子宫内胚泡着床数量及子宫器官指数，阻碍胚胎发育。在胚胎着床过程中，子宫内膜蜕膜化是保证胎盘形成和维持成功妊娠的关键生理过程，蜕膜化异常会导致早期胚胎丢失和流产等不利的妊娠结局[3]。正常情况下，着床期子宫内膜间质水肿，蜕膜化细胞围绕着植入囊胚，主要分布在子宫腔和子宫腺上皮细胞中[18]。在胚胎着床期施以24 h限制应激处理，导致孕鼠子宫内膜脱落并伴随着阴道出血，显微镜下观察到蜕膜细胞坏死，子宫内膜蜕膜层与基底层分离[19]。本研究中，RS组子宫内膜间质疏松化程度较低，子宫腔附近细胞蜕膜化现象不明显，子宫腺数量降低，子宫腺上皮细胞排列不规则且有空泡化现象；LYC预处理后，LRS组子宫内膜间质水肿，在靠近植入的囊胚、子宫腔附近细胞出现明显蜕膜化，子宫腺数量增多；从子宫形态学指标上，LYC预处理后，着床期孕鼠的子宫内膜及子宫腺相对面积比例增加，并且使子宫器官指数显著升高86.36%，胚胎着床数目由应激组的9.60±0.24增加为14.20个。因此，可以推测LYC通过促进限制应激孕鼠子宫内膜蜕膜化、子宫腺发育，促进着床期子宫发育，改变着床期子宫内膜的容受性状态，利于胚泡的顺利着床。3.3番茄红素对限制应激孕鼠子宫局部抗氧化水平的影响本课题组前期研究发现，限制应激所诱导的子宫氧化应激是导致胚胎着床异常的主要原因[3]。氧化应激可通过增加ROS和MDA含量，诱导子宫内膜基质细胞凋亡进而干扰子宫内膜蜕膜化进程[18]。过量的ROS可通过降低抗氧化酶活性或影响炎症因子表达，诱导子宫局部产生氧化应激损伤[4]。本研究中，限制应激处理后，着床期孕鼠子宫组织中T-AOC降低而脂质过氧化产物MDA含量增加，表明限制应激诱导E5孕鼠子宫发生氧化应激，LYC预处理后能够通过增加限制应激着床期孕鼠子宫组织中SOD、GSH-Px活性和T-AOC，降低脂质过氧化产物MDA的生成，表明LYC能够缓解限制应激导致的着床期孕鼠子宫氧化损伤。番茄红素作为具有强抗氧化活性的饲料添加剂，能够提高增加囊胚形成率[8]，增加胎盘抗氧化能力，具有提高母猪繁殖性能的功效[9]。由此可推测，本研究中LYC能够增加胚胎着床数目，促进子宫内膜蜕膜化，与子宫局部的抗氧化水平密切相关。研究发现，LYC可通过调节Nrf2/NF-κB转录途径，改善氧化应激引起的炎症反应[20]；通过Nrf2/HO-1有效缓解六价铬诱导的雏鸡卵巢氧化应激[6]；通过激活Nrf2-AMPK信号通路调控抗氧化酶表达，进而拮抗阿特拉津造成的肾脏氧化应激[21]。Nrf2作为氧化应激相关的转录调控因子，通过与基因启动子中的抗氧化反应元件ARE结合，调节抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达。Nrf2调节异常与不利的妊娠结局诸如早产、子痫症、生殖毒性、宫内胎儿发育迟缓、妊娠糖尿病等密切相关，Nrf2基因敲除小鼠表现为胎盘氧化应激，并出现胎儿生长阻滞现象[22]。本研究发现，LYC能够提高限制应激着床期孕鼠子宫组织中Nrf2 mRNA表达水平，这也解释了LYC能够缓解限制应激所导致的着床期孕鼠子宫氧化损伤，进而有利于胚胎着床这一现象。3.4番茄红素对限制应激孕鼠子宫局部免疫水平的影响氧自由基可以激活NF-κB和AP-1蛋白，诱发炎症反应。巨噬细胞产生ROS和促炎细胞因子，进一步诱导氧化应激和炎症反应[23]。14 h的急性限制应激能够增加小鼠肝脏中IL-1β、IL-2和IL-6的水平以及MDA含量，诱导肝脏发生炎症反应和氧化损伤[24]。免疫因子IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α在人和动物妊娠早期子宫内膜、胚胎或胎盘组织中均有表达，在调节维持胚胎存活的子宫局部免疫微环境中发挥重要作用[25]。在胚泡植入前期，子宫内TH1细胞（分泌IL-2、IFN-γ）和促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α）发挥重要作用；在胚泡完成胚胎着床后，抗炎细胞因子（IL-10、TGF-β1）发挥主导作用，但在胚泡植入前期促炎因子的过表达将导致免疫失衡，诱发着床失败[26]。研究发现，子宫组织TNF-α mRNA的高表达会降低胚胎着床数量[27]。本研究发现，LYC可降低限制应激着床期孕鼠子宫组织中IL-4、TNF-α、INF-γ mRNA表达，增加IL-2 mRNA表达。这也侧面证实了LYC可通过调控子宫局部免疫微环境，为囊胚的顺利着床提供条件。研究发现，LYC可通过提高Nrf2 mRNA表达水平，降低小鼠前列腺中IL-2、IL-6、TNF-α mRNA的表达水平[28]。由此可推测，本研究中，LYC通过增加Nrf2的核转位，通过诱导抗氧化酶活性升高，保护细胞免受氧化应激，进而减轻炎症反应，保证胚泡的顺利着床。因此，后续试验将从Nrf2介导的多种信号通路入手，继续探究LYC对限制应激孕鼠子宫内膜发育的影响。4结论番茄红素可通过激活核转录因子Nrf2的表达，诱导子宫局部抗氧化酶活性，降低脂质过氧化物水平，缓解子宫局部氧化应激，进而影响子宫局部细胞因子的表达，降低免疫反应，改善限制应激所致的子宫内膜发育异常，促进应激孕鼠子宫内胚胎着床进程。