乳酸菌主要是由一类形态相似、代谢和生理特征相近的革兰氏阳性细菌组成[1]，广泛存在于自然界，且具备多种益生功能[2]。目前，乳酸菌在畜禽饲料[3]、食品[4]、医药[5]等领域应用较多。粪肠球菌作为一种饲料中常用的益生菌之一[6]，能够提高动物的生长性能[7]，维持胃肠道微生态平衡，改善平均日增重和料重比[8]，改善动物的血液生化指标[9]，保障机体的健康状态，提高体内抗体水平[10]，提高机体免疫力，从而增强对疾病的抵抗力[11]。乳酸作为乳酸菌的主要代谢产物之一，可对某些微生物产生抑制作用[12]，提高动物的免疫力和抗病能力，改善饲料适口性，增加动物进食量[13]。因此，获得能够高产乳酸的益生菌对饲料业及养殖业具有重要意义。本研究从健康仔猪的新鲜粪便中初步筛选得到一批乳酸菌，经乳酸含量检测确定1株高产乳酸的粪肠球菌，并对其进行抑菌能力测试、体外抗逆性和胃肠道条件模拟试验，为该菌株在畜禽养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1样品来源供试样品采自河南省鹤壁市浚县屯子镇猪场，选择未满月仔猪，在粪便排泄高峰时段使用无菌装置收集新鲜仔猪粪便，放入冷藏盒中保存，于24 h内完成分离培养。1.1.2主要试剂蛋白胨、硫酸镁、碳酸钙等分析纯试剂及细菌DNA提取试剂盒、乳酸测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，粪肠球菌显色平板及乳酸菌生化鉴定试剂盒购自青岛海博生物公司，分子生物学试剂购自华大基因公司，人工肠液、人工胃液购自scientific phygene公司。抑菌试验所用菌株由河南省微生物工程重点实验室提供。1.1.3培养基MRS固体培养基：酵母膏0.5%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、乙酸钠0.5%、葡萄糖2%、柠檬酸二铵0.2%、硫酸锰0.025%、硫酸镁0.05%、吐温8%、琼脂粉2%，pH值6.4，121 ℃灭菌20 min。碳酸钙固体培养基：酵母膏0.5%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、柠檬酸二铵0.2%、葡萄糖2%、乙酸钠0.5%、吐温8%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.025%、碳酸钙1%、琼脂粉2%，pH值6.4，121 ℃灭菌20 min。营养琼脂培养基：蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂粉2%，pH值7.3，121 ℃灭菌20 min。1.1.4主要仪器荧光显微镜（zeiss公司）、RC 6PLUS型高速冷冻离心机（SORVALL）、分子成像仪（Bio-Rad公司）、QYC2012C控温摇床（上海福玛实验设备公司）、Thermoblock PCR扩增仪（Biometra公司）等。1.2测定指标及方法1.2.1高产乳酸菌株的初筛称取仔猪粪便用无菌水制成混悬液，8 000 r/min离心10 min，依次制成10-1、10-3、10-5、10-7梯度，分别涂布于MRS平板，于37 ℃培养24 h，次日挑取单菌落于MRS平板纯化。获取纯化菌株后依次使用接种针点接于碳酸钙固体平板，37 ℃培养48 h，观察碳酸钙透明圈的大小。1.2.2产乳酸能力测试根据碳酸钙透明圈的大小选择产酸能力较强的6株菌，分别接种MRS液体培养基，于37 ℃、180 r/min摇床培养，12 000 r/min离心10 min取上清检测24 h、48 h的乳酸产量，确定高产乳酸的最佳菌株。1.2.3菌株鉴定1.2.3.1形态学鉴定将目标菌株接种于MRS平板和显色平板，37 ℃培养24 h，观察记录菌株的外观形态特征和革兰氏染色结果。1.2.3.2生理生化分析利用乳酸菌生化鉴定试剂盒对目标菌株的生化特征进行鉴定，制备菌悬液加入生化管中37 ℃培养24 h，监测生化反应结果。1.2.3.3分子生物学鉴定对筛选得到的目标菌株接种MRS液体培养基于37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，利用细菌DNA提取试剂盒对菌株基因组进行提取，将提取基因组作为模板进行PCR扩增。正向引物为27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3'），反向引物为1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反应体系为：BGI2×Super PCR Mix 25 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、模板1 μL、dd H2O 22 μL。扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸5 min。对扩增后产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，送至华大基因公司测序，将测通序列输入NCBI数据库比对，并采用发育树软件MEGA 7.0构建系统发育树。1.2.4抑菌试验为探究获得菌株对有害菌的抑制能力，测试目标菌株对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制效果，将金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均匀涂布于营养琼脂平板，将灭菌滤纸片放于上述平板中，目标菌株于MRS液体培养基37 ℃摇床培养48 h，菌液离心取上清，吸取上清10 μL加到滤纸片上，培养24 h，并设立空白对照组，观察并测量抑菌圈直径。1.2.5体外抗逆性试验1.2.5.1耐胆盐试验将目标菌株种子菌液按照2%的接种量接种到不同胆盐浓度（0、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%）MRS培养基中，并在0、1、2、3、4 h时监测活菌数量。1.2.5.2耐酸试验将目标菌株种子菌液按照2%的接种量接种到不同pH值（2、3、4）MRS培养基中，并在0、1、2、3、4 h时监测活菌数量。1.2.6胃肠道条件模拟试验1.2.6.1人工胃液模拟试验将目标菌株种子菌液以2%接种量接种至人工胃液中，不添加其他成分，并在0、1、2、3、4 h时监测活菌数量。1.2.6.2人工肠液模拟试验将目标菌株种子菌液以2%接种量接种至人工肠液中，不添加其他成分，并在0、1、2、3、4 h时监测活菌数量。2结果与分析2.1产乳酸菌株初筛结果通过将初筛获得的乳酸菌点接于碳酸钙固体平板，37 ℃培养48 h，获得6株碳酸钙透明圈较大的菌株分别为SWS08、SWS17、SWS30、SWS50、SWS521、SWS67。不同乳酸菌的碳酸钙透明圈结果见图1。由图1可知，SWS08、SWS17、SWS30、SWS50、SWS521、SWS67的碳酸钙透明圈大小依次为8.5、8.3、8.2、8.4、8.3、8.5 mm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.F001图1不同乳酸菌的碳酸钙透明圈结果2.2不同菌株24 h、48 h乳酸产量（见表1）由表1可知，6株乳酸菌24 h发酵后平均乳酸产量可达60.00 mmol/L以上，SWS67的24 h发酵乳酸产量最高为82.00 mmol/L。6株乳酸菌48 h发酵后平均乳酸产量可达80.00 mmol/L以上，SWS50的48 h发酵乳酸产量最高为117.90 mmol/L。因此，确定高产乳酸的最佳乳酸菌为菌株SWS50。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.T001表1不同菌株24 h、48 h乳酸产量菌株24 h乳酸产量48 h乳酸产量SWS0873.78±0.91115.48±1.32SWS1781.18±0.8794.17±0.24SWS3077.38±0.8365.33±0.70SWS5076.79±0.75117.95±1.42SWS52123.32±2.8075.04±0.31SWS6782.00±0.6379.25±0.75mmol/L2.3菌种鉴定结果2.3.1菌株SWS50外观形态特征（见图2）由图2（a）可知，菌落呈白色、表面湿润、不透明，边缘整齐。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.F002图2菌株SWS50外观形态特征（a） 菌落形态 （b） 显色平板形态 （c） 革兰氏染色图由图2（b）可知，此菌株在显色平板上呈紫红色，属于肠球菌属正常形态。由图2（c）可知，革兰氏染色结果为阳性，菌体呈椭球形，单个或成对排列。2.3.2菌株SWS50生化反应结果（见表2）由表2可知，菌株SWS50生化反应结果符合粪肠球菌的生化特征。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.T002表2菌株SWS50生化反应结果项目结果项目结果七叶苷+蔗糖+纤维二糖+棉籽糖-麦芽糖+菊糖+甘露醇+乳糖+水杨苷+1%马尿酸钠+山梨醇+注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性。2.3.3分子生物学鉴定结果（见图3）由图3可知，通过对菌株SWS50的基因组进行提取，对16S rDNA 进行PCR扩增，扩增产物长度为1 422 bp，处于1 000~2 000 bp之间，符合细菌的一般特征。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.F003图3菌株SWS50 DNA电泳结果注：marker为DL 2 000；SWS50为PCR扩增产物。2.3.4菌株SWS50系统发育树结果（见图4）由图4可知，分离株与粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的相似性达到100%，利用MEGA 7.0构建系统发育树，发现其与粪肠球菌的亲缘关系最近。研究表明，结合菌株SWS50的外观形态特征、生化反应结果、分子生物学鉴定等结果综合确定该菌株为粪肠球菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.F004图4菌株SWS50系统发育树结果2.4菌株SWS50对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制作用（见图5）由图5可知，试验组抑菌圈直径明显大于对照组，试验金黄色葡萄球菌抑菌圈平均外径达到12.9 mm，沙门氏菌抑菌圈平均外径达到9.1 mm，表明该菌株确实可有效抑制金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.F005图5菌株SWS50对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制作用2.5体外抗逆性试验2.5.1菌株SWS50耐胆盐试验结果（见图6）由图6可知，该菌株在含胆盐培养基中生长，在低浓度胆盐培养基中菌体生长基本不受影响，随着胆盐浓度逐渐增加，菌株存活率逐渐下降。当胆盐含量为0.30%时在4 h存活率仍然可达到33.75%，表明菌株具有较高的抗胆盐能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.F006图6菌株SWS50耐胆盐试验结果2.5.2菌株SWS50耐酸试验结果（见图7）由图7可知，该菌株能够在pH值为2~4的培养基中生长，随着pH值逐渐降低及时间逐渐增加，菌株存活率逐渐下降。当pH值为2时，菌株2 h存活率可达到75.0%，当pH值为3时，菌株4 h存活率可达到74.2%，说明菌株具有良好的耐酸能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.F007图7菌株SWS50耐酸试验结果2.6胃肠道条件模拟试验结果（见图8）由图8可知，该菌株在人工胃液中生长能力较弱，随着时间逐渐增加，菌株存活率逐渐下降，分析可能是因为胃蛋白酶原对菌株产生的抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.020.F008图8胃肠道条件模拟试验结果该菌株在人工胃液中4 h存活率为13.2%，在人工肠液中基本可以正常生长，存活率较高。3讨论随着国家关于饲料中“减抗限抗”政策执行，亟须寻找抗生素的替代品[14]。益生菌作为养殖业绿色发展的新出路，能够稳定微生物区系[15]，激活免疫系统[16]，促进动物生长[17]，缓解腹泻疾病，改善肠道健康[18]，在现代新型饲料中占据重要作用。粪肠球菌是肠道益生菌之一[19]，具有多种益生功能[20]，可通过产生胞外多糖增加肠道黏附，增加益生菌定植，抑制产肠毒素大肠杆菌增殖，从而促进猪的生长[21]。本研究从仔猪新鲜粪便中初筛得到一批乳酸菌，采用碳酸钙透明圈法确定了6株产酸能力较强的菌株，对乳酸菌24 h和48 h的产乳酸能力进行了筛选，最终得到1株高产乳酸菌株。通过对高产乳酸菌株的菌落形态观察、生化鉴定分析、16S rDNA序列分析、系统发育树进化分析等手段，确定菌株SWS50为粪肠球菌。通过进一步的抑菌试验，发现该菌株能够明显抑制金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生长，表明该菌株的代谢产物能够提高饲喂动物的抗菌能力和免疫力，可帮助减少疾病发生。此外，该菌株表现出较好的耐胆盐和耐酸特性，能够在人工胃肠道条件下保持较高的存活率，表明其具备较强的益生特性，为其在胃肠道中发挥益生功能及应用于畜禽饲料提供参考。4结论本试验从猪场仔猪新鲜粪便中筛选到1株高产乳酸菌株，通过种属鉴定确定该菌株为粪肠球菌，抑菌试验、抗逆性试验和胃肠道模拟试验结果表明，该粪肠球菌具备不错的益生特性，可作为饲料添加剂中的潜力益生菌株。