克氏原螯虾（Procambarus clarkii），俗称小龙虾，属蝲蛄科（Cambaridae）原螯虾属（Procambarus）动物[1]。关于小龙虾的研究报道主要集中在生长[2-3]、系统发育与进化[4-5]、疾病与免疫[6-9]、营养与饲料等方面[1,10]，关于小龙虾肠道微生物的研究鲜有报道。肠道微生物栖居于宿主肠道内，与宿主形成共生关系。肠道微生物及其代谢产物作为宿主体内庞大且复杂的微生态系统，能够调节宿主健康，在宿主消化与代谢、疾病与免疫等方面也发挥重要作用[11-12]。肠道微生物的结构组成和多样性是影响宿主生理健康的重要因素，在膳食和宿主之间起重要的桥梁作用[13]。小龙虾的生理代谢受自身基因操控和肠道微生物调控的影响。微生物制剂是利用益生菌及其代谢产物制成的一种药物制剂[14-15]，肠道内的益生菌群结构与动物体的健康息息相关。微生物制剂作为饲料添加剂，可增强水产动物免疫力，抑制有害微生物增殖，维持动物肠道的菌群平衡。添加益生菌能够合成消化酶，与宿主自身合成的消化酶一起消化肠道中的营养物质，提高水产动物对饲料的利用率[16-17]。本研究利用从小龙虾肠道中分离的枯草芽孢杆菌CP-3，制备CP-3菌剂，并结合乳酸菌菌剂、酵母菌菌剂，配制含微生物制剂的饵料投喂小龙虾，研究微生物制剂对小龙虾生长和肠道细菌菌群结构的影响，为调节小龙虾肠道微生物提供参考。1材料与方法1.1试验材料小龙虾由本校小龙虾养殖基地提供。枯草芽孢杆菌CP-3（有效活菌数≥10×109 CFU/g）为实验室从小龙虾肠道分离菌株，乳酸菌（有效活菌数≥10×109 CFU /g）、酵母菌菌剂（有效活菌数≥10×109 CFU /g）均购自北京科为博生物科技有限公司，扶龙龙虾配合饲料购自湖北渴望牧业有限责任公司。1.2主要试剂和仪器无水碳酸钙购自国药集团化学试剂有限公司，9KLP-125型颗粒饲料压制机购自郑州市新郑勇丰机械设备有限公司，无菌操作台购自苏州净化设备有限公司。LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g、氯化钠10.0 g、酵母抽提物5.0 g、琼脂粉15.0 g，pH值7.0，1×105 Pa灭菌20 min。1.3微生物制剂制备从小龙虾肠道中筛选的枯草芽孢杆菌CP-3，活化后制备种子液，发酵72 h的菌液离心后收集菌体，使用灭菌的无水碳酸钙与湿菌体以3∶1比例混匀，拌成菌粉，70 ℃烘箱内干燥20 min，研磨成干粉即为枯草芽孢杆菌CP-3菌剂。将枯草芽孢杆菌CP-3原菌粉2份、乳糖10份以及可溶性淀粉88份混匀（均为重量份数），即为枯草芽孢杆菌CP-3活菌制剂。1.4微生物制剂饵料配制为检测不同菌剂饵料配方对小龙虾肠道菌群结构的影响，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以枯草芽孢杆菌CP-3添加量（1%、4%、7%）、乳酸菌添加量（0.1%、0.4%、0.7%）、酵母菌添加量（0.1%、0.4%、0.7%）为考察对象，以增重率为响应值，采用响应面分析软件3因素3水平设计饲料配方，设置对照组。饵料中添加了麸皮以调节各组试验饵料的纤维素含量为20%，为课题组后期调整饵料配方，增加纤维素含量，降低饵料成本提供基础。试验组菌剂饵料配方组成见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.017.T001表1试验组菌剂饵料配方组成组别CP-3/%乳酸菌/%酵母菌/%扶龙饲料/g麸皮/g黏合剂/g合计/g140.40.4356.7379.2740500270.40.1345.6876.8240500340.70.1356.7379.2740500410.40.7367.7781.7340500510.70.4367.7781.7340500610.10.4370.2382.2740500740.40.4356.7379.2740500840.40.4356.7379.2740500970.70.4343.2376.27405001070.40.7343.2376.27405001140.10.7356.7379.27405001270.10.4345.6876.82405001340.70.7354.2778.73405001440.10.1359.1879.82405001540.40.4356.7379.27405001640.40.4356.7379.27405001710.40.1370.2382.274050018000500.00005001.5试验设计及饲养管理选取大小相近、附肢健全、健康无患病的小龙虾900尾，随机分成18组，每组5个重复，每个重复10尾虾。每日8：00和18：00进行饲喂，投喂量为小龙虾体重的3%，并根据其摄食情况加以调整。试验期5周。1.6测定指标及方法1.6.1生长性能试验正式开始及结束前小龙虾饥饿1 d，使用电子天平测量各养殖箱中小龙虾的数量和重量，记录每个养殖箱投喂饲料的总量，统计小龙虾末重，计算增重率以及特定生长率。增重率=(末重-初重)/初重×100%(1)特定生长率=(ln末重-ln初重)/试验天数×100%(2)1.6.2小龙虾全肠总DNA的提取根据不同分组小龙虾的生长情况，选取对照组和生长最优组活体小龙虾，使用70%酒精、无菌水依次清洗体表，在超净工作台解剖得到小龙虾全肠，置于无菌的离心管中。使用灭菌的匀浆棒匀浆，按照CTAB方法提取小龙虾全肠总DNA，电泳检测DNA浓度和纯度，送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序。1.6.3小龙虾肠道16S rRNA基因的高通量测序1.6.3.116S rRNA基因V4区的PCR扩增以提取的肠道总DNA为模板，使用合成的带有Barcode的特异引物以及高效高保真酶进行PCR扩增，试验所用的酶购自New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，进而保证PCR扩增的效率和准确性。1.6.3.2PCR产物的混样和纯化根据PCR产物的浓度，进行等浓度混样，充分混匀，使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用Qiagen公司凝胶回收试剂盒切胶回收目的条带。1.6.3.3文库构建和测序使用TruSeq® DNA Sample Preparation Kit进行文库构建，能够高效利用有限的DNA样本，保证高覆盖度。构建好的文库经过Q-PCR和Qubit定量，合格后使用HiSeq 2500进行上机测序。1.6.3.4生物信息分析根据barcode序列将测序数据分配到各个样品，使用Cutadapt和Trimmomatic软件进行数据质控，将得到的高质量clean data，使用FLASH软件合并双末端的reads得到tags序列，统计数据量。使用UPARSE软件进行OTU（Operational Taxonomic Units）聚类以及QIIME平台进行OTU的物种注释，进行物种的α多样性分析（Alpha Diversity）和组成分析。2结果与分析2.1不同菌剂饵料对小龙虾生长性能的影响（见表2）由表2可知，与第18组相比（未加菌剂组），第17组（1%枯草芽孢杆菌CP-3、0.4%乳酸菌、0.1%酵母菌）小龙虾的增重率最高，为86.37%，因此选取该组小龙虾进行细菌菌群结构分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.017.T002表2不同菌剂饵料对小龙虾生长性能的影响组别初重/g末重/g增重率/%特定生长率/(%/d)18.7015.2775.521.6128.6815.8282.261.7238.7515.3775.661.6148.6714.7369.901.5158.7714.9170.011.5268.7315.5778.351.6578.7115.3175.771.6188.7715.3975.481.6198.6716.0585.121.76108.7315.1873.881.58118.7315.6278.921.66128.6814.8270.741.53138.7715.7379.361.67148.7816.1383.711.74158.7515.2774.511.59168.7615.3575.231.60178.7316.2786.371.78188.7114.3464.641.422.2MiSeq测序概况为研究小龙虾肠道的物种组成多样性，使用Uparse软件筛选总丰度大于1的Unique tags，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs。Uparse构建OTUs时选取每个类中出现频数最高的序列为代表性序列，将这些代表性序列集合用RDP Classifier与Silva数据库序列进行物种注释分析。小龙虾肠道细菌序列的标记和OTUs的数目见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.017.T003表3小龙虾肠道细菌序列的标记和OTUs的数目组别有效Tags数目OTU总数目成功注释的OTUSY1组40 1019898SY2组88 913253253注：SY1组为未添加菌剂，SY2组为添加菌剂；下表同。2.3不同菌剂饵料对小龙虾肠道细菌Alpha多样性的影响（见表4）由表4可知，稀释曲线在0~50 000的测序数量范围内，随着测序数量的增加，稀释曲线的斜率逐渐降低，在测序数量超过30 000后曲线逐渐趋近平坦，进入平台期，表明继续增加测序数量只会产生少量新的OTU。Shannon指数曲线的斜率在0~10 000的测序数量范围内快速上升，然后进入平台期，表明本研究的测序数据量已经能够反映样品绝大多数的微生物信息。本研究中样品SY1组、SY2组的Rank-abundance曲线趋于平滑下降，表明小龙虾肠道菌群的物种组成多样性较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.017.T004表4不同菌剂饵料对小龙虾肠道细菌Alpha多样性的影响组别Chao1指数Shannon指数Simpson指数Coverage指数SY1组98.0002.554 90.121 11.000 0SY2组381.2875.069 40.938 01.000 02.4不同菌剂饵料对小龙虾菌群构成的影响2.4.1小龙虾肠道细菌群落门水平结构组成（见图1）由图1可知，SY1组小龙虾肠道变形菌门（Proteobacteria）细菌占35.14%，拟杆菌门（Bacteroidetes）细菌占27.5%，软壁菌门（Tenericutes）细菌占25.83%，厚壁菌门（Firmicutes）细菌占6.1%。SY2组小龙虾肠道菌群中Proteobacteria细菌占49.07%，Bacteroidetes细菌占15.22%，Firmicutes细菌占14.21%，软壁菌门（Teneticutes）细菌占2.79%；暂定的RsaHF231门细菌有所增加，占18.11%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.017.F001图1小龙虾肠道细菌群落门水平结构组成2.4.2小龙虾肠道细菌群落属水平结构组成（见图2）由图2可知，SY1组小龙虾肠道细菌菌群相对丰度较高的为Candidatus Bacilloplasma（24.90%）、拟杆菌属（23.44%），其次是弧菌属（Vibrio）（10.11%）、不动杆菌属(Acinetbobacter）（3.81%）、Dysgonomonas（2.99%）、Tyzzerella 3（2.06%）、气单胞菌属（Aeromonas)（1.13%）和希瓦氏菌属（Shewanella）（1.05%）。SY2组小龙虾肠道的希瓦氏菌属、[Anaerorhabdus] furcosa group、Hafnia-Obesumbacterium、Citrobacter、Flavobacterium属细菌相对丰度有所增加，分别占比为10.61%、7.31%、6.35%、6.34%、5.81%；而Vibrio细菌相对丰度有所下降，由10.11%降至4.68%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.017.F002图2小龙虾肠道细菌群落属水平结构组成3讨论3.1微生物制剂对小龙虾肠道菌群结构的影响复合微生物制剂是由两种或多种微生物按合适比例共同培养，充分发挥群体的联合作用优势，取得最佳应用效果的一种制剂[18]，主要由枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等多种益生菌组合而成。微生物制剂具有增强水产动物免疫力、调节宿主肠道菌群结构、抑制有害微生物增殖的作用，其在一些畜禽和水产动物的养殖过程中已有应用。田良等[19]研究饵料中添加微生物制剂对仿刺参生长与免疫的影响，表明联合使用的复合菌制剂的效果最好，能够显著提升仿刺参特定生长率、消化酶活性和免疫相关因子水平。石宝明等[20]探讨微生物制剂对猪生产性能、免疫功能的影响，结果表明，添加复合微生物制剂可降低仔猪腹泻率，提高仔猪免疫能力。何敏等[21]在重口裂腹鱼基础饵料中添加微生物制剂，结果发现，微生物制剂能够改善水质，提高重口裂腹鱼肠道消化酶活性，增加肠道芽孢杆菌等益生菌群数，促进鱼体生长。原因是益生菌可以通过营养和空间竞争影响宿主肠道细菌群落的生长，抑制有害细菌生长，改变肠道中细菌的群落结构，从而改善宿主的生长状况。本研究发现，小龙虾肠道内细菌物种多样性较丰富，变形菌门是小龙虾肠道的优势菌群，与陈一铭等[22]研究结果一致。本试验中，与未添加微生物制剂组相比，添加微生物制剂组小龙虾肠道内细菌生物多样性和物种丰富度均显著增加，表明小龙虾肠道菌群更趋丰富和稳定，对环境适应能力越强；且添加微生物制剂组小龙虾肠道内菌群结构也呈较大改变，主要表现在一些益生菌物种数量增加。芽孢杆菌是重要的益生菌类群，已广泛应用于水产养殖，而芽孢杆菌和乳酸菌均属于厚壁菌门细菌。本试验中，饵料中添加微生物制剂后，小龙虾肠道厚壁菌门细菌含量由原来的6.1%提高至14.21%，一些有害菌群的数量也有所减少，弧菌属数量由原来的10.11%降低至4.68%。添加微生物制剂改善了小龙虾肠道菌群结构，对于提高小龙虾免疫力、调节小龙虾健康具有积极作用。高通量测序提供的菌群物种组成和丰度等数据，对研究小龙虾肠道微生物间的相互作用关系、微生物与宿主间的相互关系以及食物在肠道内的降解机制均具有重要意义。3.2微生物制剂对小龙虾饲料利用率的影响目前，小龙虾养殖饵料的缺乏以及小龙虾对饵料的利用率不高，是制约小龙虾养殖产业快速发展的因素之一。未被消化的饵料随小龙虾粪便排到环境中，对养殖环境造成污染。因此，需要开发小龙虾养殖专属饵料，提高小龙虾对饵料的利用率。微生物制剂中的益生菌，可以改善小龙虾肠道菌群结构，可合成消化酶，与动物体合成的消化酶共同参与肠道中营养物质的消化，提高水产动物对饵料的利用率。温茹淑等[23]将1%的复合微生物制剂作为饵料添加剂投喂草鱼，发现复合微生物制剂能够有效促进草鱼的生长与提高消化能力。刘冬姣[24]探讨复合微生物制剂对仔猪生长性能及粪便中NH3和H2S含量的影响，发现微生物制剂可提高仔猪生长性能，降低粪便中H2S和NH3含量，提高饲料利用率。本试验中，分离自小龙虾肠道中的枯草芽孢杆菌CP-3，具有纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等多种消化酶活性，能够有效辅助小龙虾对饵料的消化。这些益生菌投喂小龙虾后，能够较好地在小龙虾肠道内定植，参与饵料降解，提高小龙虾对饵料的利用率。4结论本研究结果表明，添加微生物制剂可以调节小龙虾肠道细菌群落结构，主要表现在厚壁菌门（如芽孢杆菌）等益生菌增加，有害菌减少（如弧菌属），小龙虾肠道内细菌生物多样性和物种丰富度均显著增加，肠道菌群更趋丰富和稳定。