现代商品肉鸡经过高强度的人工选育，具有生长速度快、产肉率高的特点。但由于鸡体表绝大部分覆盖羽毛且缺乏汗腺，导致肉鸡极易受到热应激影响。关于热应激导致鸡的行为、生理、生殖和免疫反应等方面发生的异常变化及其对鸡生长发育和生产性能造成的不利影响的研究较多[1-2]。热应激引起鸡生理反应变化涉及呼吸速率和血液pH值、血浆离子浓度、心血管功能和激素效应[3]，鸡的胸腺、法氏囊和脾脏等免疫器官的重量明显降低[4-5]，B淋巴细胞和T淋巴细胞显著减少[6]。大脑皮层、下丘脑等中枢神经系统在热应激过程中起主导作用[7]。微阵列和生物信息学方法已被广泛应用于基因组水平上筛选DEGs。热应激条件下，鸡下丘脑有38个DEGs，上调基因主要集中于基因表达调控、大分子生物合成过程的调控、核酸代谢过程的调控、转录调控和DNA代谢过程[8]。在热应激鸡大脑中检测到166个DEGs，其中6个基因在大脑、腿肌、肝脏组织中均有差异表达[9]。短暂热应激时，高恐惧型肉鸡大脑组织中HSP70表达量高于低恐惧型肉鸡[10]。本研究从美国国立生物技术信息中心（NCBI）的GEO数据库中获取经热应激处理的鸡大脑组织和下丘脑组织两套基因芯片数据集，进行生物信息学数据二次挖掘，筛选与热应激有关的重要脑组织共享DEGs，对其分别进行GO和KEGG富集分析，构建蛋白质互作网络，利用Cytohubba插件筛选关键基因，分析热应激时鸡脑组织共享DEGs的分子作用机理，为深入研究与鸡热应激有关疾病的发病机制提供参考。1材料与方法1.1基因芯片表达谱数据集从NCBI的GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取GSE 23592基因芯片数据集和GSE 37400基因芯片数据集。GSE 23592基因芯片数据检测平台为GPL 3213（Affymetrix Chicken Genome Array），其试验设计是将24只黄羽肉鸡随机分为2组，对照组试验温度（28±1）℃，热应激组试验温度（40±1）℃，两组持续时间均为3 h。GSE 37400基因芯片数据检测平台为GPL13790（Agilent-026441 Gallus gallus Oligo Microarray v2），其试验设计是将8只肉鸡随机分为2组，每组4只鸡，对照组试验温度25 ℃，热应激组试验温度34 ℃，两组持续时间均为24 h。1.2DEGs识别GEO2R是一个交互式网络工具，允许用户比较GEO系列数据库中的两个或多个数据集，进而在试验条件下识别出DEGs[11]。利用GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r /）分析GSE 23592和GSE 37400两个基因芯片数据集中的DEGs，其中显著上调基因的阈值标准为P0.05且logFC1，显著下调基因的阈值标准为P0.05且logFC-1。利用在线数据分析和可视化平台微生信（http://www.bioinformatics.com.cn）分别绘制这两个基因芯片数据集的DEGs火山图。利用微生信平台绘制维恩图，保留共享DEGs以供进一步分析。1.3GO功能分析与KEGG通路富集分析GO功能分析是利用高通量基因组或转录组的数据，进行基因注释和生物学特征鉴定的一种有用方法[12]。应用在线分析工具David（https://david.ncifcrf.gov）对利用微生信平台获得的两个基因芯片数据集的共享DEGs进行GO功能分析和KEGG通路富集分析，深入理解这些被识别基因的分类及其功能，P0.05表示显著富集。1.4蛋白互作网络构建及枢纽基因筛选将32个共享DEGs导入STRING在线数据库（https://cn.string-db.org），将综合得分大于0.4的蛋白质互作数据结果导入Cytoscape3.9.1软件中绘制蛋白质互作网络图，并利用Cytohubba插件degree法识别并筛选蛋白质互作网络中的枢纽基因。2结果与分析2.1两个基因芯片数据集的DEGs筛选结果（见图1）由图1可知，对GSE23592数据集按要求筛选后，共获得292个DEGs，其中显著表达上调基因203个，显著表达下调基因89个；对GSE37400数据集筛选后，获得1 004个DEGs，其中显著表达上调基因726个，显著表达下调基因278个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.021.F001图1两个数据集的DEGs火山图2.2两个基因芯片数据集的共享DEGs获取结果（见图2）由图2可知，GSE37400与GSE23592共享DEGs有32个，其中显著表达上调基因27个，分别是丝氨酸酶抑制蛋白D1（SERPIND1）、丝氨酸酶抑制蛋白A4（SERPINA4）、丝氨酸酶抑制蛋白A10（SERPINA10）、丝氨酸酶抑制蛋白A1（SERPINA1）、纤维蛋白原α链（FGA）、纤维蛋白原β链（FGB）、纤维蛋白原γ链（FGG）、载脂蛋白B（APOB）、脂肪酸结合蛋白1（FABP1）、纤溶酶原（PLG）、DnaJ 热休克蛋白家族(Hsp40)成员A4（DNAJA4）、类胰岛素生长因子结合蛋白1（IGFBP1）、丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）、醛缩酶（ALDOB）、细胞核转运因子2（NUTF2）、钠电压门控通道α亚单位1（SCN1A）、肌球蛋白结合蛋白C（MYBPC1）、精子发生相关蛋白18（SPATA18）、富含半胱氨酸和组氨酸的结构域1（CHORDC1）、酪氨酸转氨酶（TAT）、白蛋白（ALB）、α-1-微球蛋白（AMBP）、维生素D结合蛋白（GC）、革兰氏结构域3（GRAMD3）、胞内A颗粒促进多肽（IPP）、RNA聚合酶Ⅱ亚基B（POLR2B）、肝核糖核酸酶A（CL2）。显著表达下调基因5个，分别是亚铁血红素结合蛋白2 （SOUL）、Ⅵ型胶原蛋白α 3链（COL6A3）、神经介质U（NMU）、同源蛋白质2（OTX2）、突触核蛋白γ（SNCG）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.021.F002图2两个数据集的共享DEGs维恩图2.3共享DEGs的GO分析及KEGG通路分析结果（见表1）由表1可知，32个共享DEGs主要参与蛋白质聚合（0051258）、纤维蛋白溶解（0042730）、血液凝固（0007596）、血小板聚集（0070527）、内肽酶活性负调控（0010951）、细胞基质黏附（0007160）、纤维蛋白凝块形成（0072378）等生物学过程，其中蛋白质聚合（0051258）P值最小，有3个基因参与；分布在纤维蛋白原复合物（0005577）、细胞外间隙（0005615）、细胞外区（0005576）、血小板α颗粒（0031091）等细胞组分中，其中纤维蛋白原复合物（0005577）P值最小，有3个基因参与；行使丝氨酸型内肽酶抑制剂活性（0004867）、伴侣蛋白结合（0051087）、相同蛋白结合（0042802）、脂肪酸结合（0005504）、受体结合（0005102）等分子功能，其中丝氨酸型内肽酶抑制剂活性（0004867）P值最小，有4个基因参与。32个共享DEGs主要参与补体与凝血级联反应（04610）、血小板活化（04611）、中性粒细胞胞外陷阱形成（04613）等少数信号通路，其中补体与凝血级联反应（04610）P值最小，有5个基因参与。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.021.T001表1共享DEGs的GO分析及KEGG通路分析结果项目类型序号简介基因数目P值GO分析生物学过程0051258蛋白质聚合30.0010042730纤维蛋白溶解30.0010007596血液凝固40.0010070527血小板聚集30.0010010951内肽酶活性负调控30.0030007160细胞基质黏附30.0060072378纤维蛋白凝块形成20.008细胞组分0005577纤维蛋白原复合物30.0010005615细胞外间隙90.0010005576细胞外区50.0100031091血小板α颗粒20.013分子功能0004867丝氨酸内肽酶抑制剂活性40.0010051087伴侣蛋白结合30.0110042802相同蛋白结合60.0250005504脂肪酸结合20.029KEGG通路—04610补体与凝血级联反应50.00104611血小板活化30.03004613中性粒细胞胞外陷阱形成30.0352.4共享DEGs的蛋白质互作分析和枢纽基因筛选结果（见图3）由图3可知，只包含16个节点和102个蛋白质互作关系。16个基因中属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的有SERPINA1、SERPINA4、SERPINA10及SERPIND1，编码纤维蛋白原的有FGA、FGB和FGG，和脂代谢紧密联系的有APOB、FABP1，还有PLG、TAT、GC、ALB、ALDOB、CL2、AMBP，且均为差异表达上调基因。此外，还有DNAJA4、IGFBP1、PDK4、NUTF2、SCN1A、MYBPC1、SPATA18、CHORDC1、GRAMD3、IPP、POLR2B、SOUL、COL6A3、NMU、OTX2、SNCG等16个共享DEGs不在图中。利用cytoHubba插件degree法筛选出degree≥14排名前7位的枢纽基因，依次为GC、FGG、FGA、FGB、PLG、APOB和FABP1，且均为差异表达上调基因。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.021.F003图3共享DEGs的蛋白互作网络图注：长方形为枢纽基因。3讨论目前利用DNA微阵列研究生物不同组织的DEGs已经非常成熟，基于GO、KEGG和蛋白质互作分析等生物信息学方法可以进一步阐明DEGs所属代谢途径、分子分类和功能预测。大脑是鸟类身体的控制器官[13]，下丘脑是大脑皮层下调节内脏活动的高级神经中枢。为研究与鸡热应激有关疾病发病机制的重要脑部共享DEGs的分子机理，从GSE37400与GSE2359两套基因芯片数据集中筛选出符合条件的共享DEGs32个，显著表达上调基因和下调基因分别为27个和5个。本研究中，富集到的有属于丝氨酸蛋白酶抑制剂A家族的SERPINA4、SERPINA1及SERPINA10等3种，仅SERPIND1属于丝氨酸蛋白酶抑制剂D家族，且均为显著表达上调基因。SERPIND1的天然靶酶是凝血酶，SERPIND1和SERPINA10缺陷或聚合均会引起血栓形成[14]。胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂在血液凝集、炎症反应、纤维蛋白溶解、免疫调节等许多生理生化及免疫方面具有重要调控作用[15-16]。旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPIs）可诱导JAK2和STAT3受体磷酸化，从而影响巨噬细胞的信号转导[17]。凝血及血栓形成会造成鸡不同组织或器官的不同程度损害，引起相关疾病。热应激环境下，肉鸡肝脏中HSP70基因表达上调，HSP70蛋白水平也上调[18]，HSP70和HSP90基因在两个地方品种鸡的表达量高于商品肉鸡系[19]。本研究富集到4个丝氨酸酶抑制蛋白均与凝血及血栓形成有关，其中DNAJA4基因是一种禽源HSP40基因，未发现HSP70和HSP90基因，可能与这两种基因在不同的组织或器官中的表达分布不同有关。DnaJ/Hsp40蛋白主要通过刺激伴侣蛋白HSP70的ATP酶活性，对蛋白质的翻译、折叠和降解起重要作用[20]。禽源HSP40是潜在的与禽呼肠孤病毒（ARV）σA蛋白互作的宿主蛋白之一[21]，DNAJA4基因的表达量在炎热条件下（大于30 ℃）的蒙古羊和杜泊羊的骨骼肌中均有所上调[22]。在热应激过程中，鸡下丘脑中DNAJC13表达上调，而HSP90表达下调[8]。本研究显示，不同组织和不同肉鸡品种之间的热应激反应的复杂性，表明机体可以积极地产生多种机制抵抗热应激。本研究通过对32个共享DEGs进行GO功能生物学过程分析和KEGG通路富集分析比较，发现均涉及血液凝固和血小板活化聚集。对鸡脑、肝脏、腿肌组织的DEGs均富集到细胞死亡生物学过程[23]。在热应激反应过程中，肉仔鸡肌组织毛细血管持续性的收缩及收缩后持续性的瘀血会造成肌细胞损伤[24]。患有冷应激综合征的佛罗里达海牛凝血因子Ⅺ活性显著升高，平均抗凝血酶活性降低，表明血栓栓塞性疾病的风险增加[25]。血液凝固和血小板活化聚集均与血管损伤后凝血过程有关；异常状况下会有形成血栓倾向，血栓栓塞引起器官或组织的血液供应减少，或某些器官或组织的血液沉积，导致器官衰竭或功能障碍甚至死亡，表明热应激会造成鸡不同组织损伤甚至鸡死亡的分子机制。通过KEGG通路富集分析可知，DEGs还参与中性粒细胞胞外陷阱形成信号通路，在其他鸡热应激的相关文献中没有报道富集该通路。中性粒细胞胞外陷阱（NETs）由染色质DNA细丝和颗粒蛋白组成，由中性粒细胞释放以捕获微生物[26]。中性粒细胞在持续炎症时不可控地释放NETs，NET积聚可产生血管阻塞、组织损伤和延长炎症[27]。在小鼠模型中，NETs的DNA成分与癌症转移有关[28]。因此，初步推测NETs形成信号通路与热应激造成鸡不同组织炎症或损伤有关。由蛋白质互作网络图可知，只涉及16个共享DEGs和102个蛋白质互作关系，但DNAJA4、IGFBP1、PDK4、NUTF2、SCN1A、MYBPC1、SPATA18、CHORDC1、GRAMD3、IPP、POLR2B、SOUL、COL6A3、NMU、OTX2、SNCG等16个共享DEGs不在其中，在STRING数据库综合得分0.4的阈值标准。原因可能是上述16个共享DEGs与其他基因间的相互作用比较少，或者是目前对鸡脑组织这些基因的功能及相互关系尚不清楚，有待进一步深入研究。由于从两个基因芯片数据集只筛选到32个共享DEGs，且只有16个基因与其他基因间存在相互关系，因此，利用cytoHubba插件筛选出排名前7位的枢纽基因研究，均为差异表达上调基因。GC基因编码一种多功能蛋白，存在于血浆、腹水、脑脊液和许多细胞类型的表面，主要功能是与维生素D及其血浆代谢物结合，并将其运输到目标组织[29]，与T细胞相结合进而参与机体免疫反应[30]，与不饱和脂肪酸相结合参与内毒素转运过程[31]。FGA、FGB和FGG基因分别编码纤维蛋白原α肽链、β肽链和γ肽链，纤维蛋白原主要参与血小板的活化聚集和血管损伤后的凝血过程[32-33]。猪纤维蛋白原刺激新西兰白兔机体后产生体液免疫应答，但在小鼠体内未表现出特异性免疫反应[34]。纤维蛋白原除介导细胞黏附外，可能与一些肿瘤的纤维蛋白原表达具有显著的相似之处[35]。PLG基因编码纤溶酶原蛋白，是纤溶酶的一种酶原形式，在纤维蛋白凝块的溶解以及在病原的黏附、定植并侵袭的过程中具有重要作用[36]。在降低纤溶酶的纤维蛋白溶解活性时，纤溶酶原氧化会引起剂量依赖效应[37]。马耳他雄犬纤溶酶原基因的外显子1完全缺失，导致纤维蛋白沉积在眼结膜中，引起强烈的结膜炎炎症反应[38]。在钩端螺旋体中，纤溶酶原参与钙黏蛋白的降解，破坏细胞间的紧密连接，使其通过细胞屏障扩散[39]。APOB和FABP1均与脂代谢密切相关；APOB基因在蛋鸡肠道和肾脏中的表达高于肉鸡，但在两个品种的肝脏中无显著差异[40]。APOB基因的表达在云南6个地方鸡种存在差异[41]。慢性热应激导致肉仔鸡肝脏脂质积聚，可能是因为数量较少的ApoB不足以转运慢性热应激肉鸡肝脏合成的过量甘油三酯[42]。脂肪酸结合蛋白4（FABP4）基因在肉鸡下丘脑中也存在差异表达[43]。在热应激条件下，肠道FABP基因表达减少可能是由于肠道的结构受到损伤和上皮细胞丢失所导致[13]。因此，热应激条件下，FABP和APOB基因在不同组织中的表达存在差异，可能与不同组织的发挥功能不同有关。4结论基于GEO数据库中GSE 23592和GSE 37400基因芯片数据集，进行生物信息学数据二次挖掘，筛选出与热应激有关的重要脑组织共享DEGs 32个。通过GO功能富集、KEGG信号通路分析及蛋白质互作网络分析，筛选出7个关键基因；通过分析其分子作用机理，共享DEGs可能与热应激过程中肉鸡不同组织或器官的损伤及发病有关。