黄芪多糖（APS）是从黄芪根部或茎分离出的黄芪主要活性成分之一[1]，由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等组成[2]，具有广泛的免疫增强和抗病作用，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等药理功效[3-5]。APS具有价格低廉、来源丰富、毒性低、药理活性广泛等优点，广泛应用于临床、畜牧及水产养殖业。研究表明，APS具有提高水产动物生长[6]、免疫功能[7-8]、抗病力[9-10]等功效。罗非鱼是我国南方重要的淡水养殖鱼类，但近年来频繁暴发的链球菌病严重制约罗非鱼的养殖。本试验在饵料中添加不同剂量的APS，研究APS对罗非鱼生长、非特异性免疫指标及抗病力的影响，为APS在罗非鱼养殖业中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用的吉富罗非鱼苗购自广东省湛江市吴川某罗非鱼种苗基地。APS购自江苏南通四海植物精华有限公司，有效含量为70%。1.2试验设计试验于广东海洋大学湛江东海岛高新科技园进行。选取外观正常、体质健壮、平均体重（19.32±0.23）ｇ的吉富罗非鱼450尾，分别在5个水泥池内进行，每个水泥池挂3个网箱，每个网箱放养30尾吉富罗非鱼，水泥池水深为1 m。预试期10 d，正式试验期28 d。对照组鱼投喂基础饵料，试验组在基础饵料中添加0.05%（0.05%组）、0.10%（0.10%组）、0.15%（0.15%组）和0.20%（0.20%组）APS，混匀，使用双螺杆制粒机挤压成粒径为2 mm的颗粒饲料，风干。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.014.T001表1基础饵料组成及营养水平原料组成含量营养水平合计100.00进口鱼粉5.00粗脂肪5.70豆粕9.00粗蛋白30.6面粉25.50粗灰分9.20菜粕44.00DDGS10.00豆油1.50卵磷脂1.00氯化胆碱0.20沸石粉1.00抗氧化剂0.02磷酸氢钙1.50防霉剂0.10食盐0.18多维多矿1.00注：1.多维多矿购自江门容川饲料有限公司。2.营养水平均为实测值。%1.3饲养管理每天于9：00和17：00投喂饵料，日投饵量为鱼体重的3%~5%。为便于观察罗非鱼的摄食情况，每个网箱挂一个投饵台，投饵后0.5 h检查投饵台中的饵料，如有剩余及时收集烘干称重。每周根据鱼的生长状况，及时调节投饲量，试验全过程不间断充气增氧，每天换水1次，换水量为2/3，水温为（30.5±1.5）℃。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验最后1 d，试验鱼停食1 d，对每个网箱中的罗非鱼进行称重，计数，计算增重率、饵料系数、成活率。增重率=(末重-初重)/初重×100%(1)饵料系数=总摄食量/鱼体重增加量(2)成活率=收获尾数/放养尾数×100%(3)1.4.2非特异性免疫指标分别在试验第0、7、14、21和28 d，从每个网箱中随机抽取5尾罗非鱼尾脉采血，置于Eppendorf管中，室温静置1 h，待其凝固，置于4 ℃冰箱保存过夜，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，收集血清，-80 ℃下保存。溶菌酶活力测定采用试管法，使用0.1 mol/L的磷酸钾盐缓冲液将溶壁微球菌配成悬液（OD570 nm≈0.3），取3 mL悬液于试管内冰浴，加入50 μL待测样品，混匀，测其吸光度（A），将试管于37 ℃温浴30 min（保温过程中保持振荡），取出，冰浴10 min，终止反应，测吸光度（A0）。计算溶菌酶（LSZ）活力。LSZ活力=(A0-A)/A (4)超氧化物歧化酶（SOD）和碱性磷酸酶（AKP）活性使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体测定步骤按说明书进行。1.4.3免疫保护率试验最后1 d，每组随机抽取15尾吉富罗非鱼，使用本实验室分离并保存的无乳链球菌对各组罗非鱼肌肉注射攻毒，注射剂量0.1 mL，感染菌悬液浓度为3×108 cells/mL。攻毒后罗非鱼分别养殖于充气玻璃钢桶中，试验期10 d，观察并记录罗非鱼死亡情况，计算免疫保护率。免疫保护率=(1-试验组死亡率/对照组死亡率)×100%(5)1.5数据统计与分析采用SPSS 19.0分析软件对数据进行单因素方差分析，Duncan's进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1APS对吉富罗非鱼生长性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，0.10%组和0.15%组吉富罗非鱼的增重率分别提高17.92%和28.96%（P0.05），饵料系数分别降低6.97%和11.56%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.014.T002表2APS对吉富罗非鱼生长性能的影响组别初重/g末重/g增重率/%成活率/%饵料系数对照组19.45±1.3130.76±2.53b58.15±1.83c97.78±1.111.73±0.03a0.05%组19.36±1.8531.54±2.38ab62.92±2.46bc98.89±1.111.70±0.03ab0.10%组19.40±1.3632.12±2.13a68.57±1.84b100.00±0.001.61±0.06b0.15%组19.35±1.5133.86±2.29a74.99±1.35a100.00±0.001.53±0.05c0.20%组19.55±1.6331.93±2.78ab63.33±2.67bc98.89±1.111.68±0.04ab注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2APS对吉富罗非鱼血清LSZ活性的影响（见图1）由图1可知，从第7 d开始，试验组吉富罗非鱼血清中LSZ活性呈升高趋势。在第7 d，0.15%组和0.20%组罗非鱼血清中的LSZ活性显著高于对照组（P0.05）。在第14 d，除0.05%组外，其他试验组罗非鱼血清LSZ活性均显著高于对照组（P0.05）。在第21 d、28 d，所有试验组罗非鱼血清LSZ活性均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.014.F001图1黄芪多糖对吉富罗非鱼溶菌酶活力的影响注：不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。2.3APS对吉富罗非鱼血清SOD活性的影响（见图2）由图2可知，在第7 d，0.15%组和0.20%组罗非鱼血清中的SOD活性显著高于对照组（P0.05）。在第14 d，除0.05%组外，其他试验组罗非鱼血清SOD活性均显著高于对照组（P0.05）；在第14 d、28 d，所有试验组罗非鱼血清SOD活性均显著高于同期对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.014.F002图2黄芪多糖对吉富罗非鱼血清SOD活力的影响2.4APS对吉富罗非鱼血清AKP活性的影响（见图3）由图3可知，在第7 d、28 d，试验组罗非鱼血清中AKP活性均显著高于对照组（P0.05）；在第14 d、21 d，试验组罗非鱼血清中的AKP活性极显著高于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.014.F003图3黄芪多糖对吉富罗非鱼血清AKP活性的影响注：不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。2.5APS对吉富罗非鱼免疫保护率的影响（见图4）由图4可知，人工感染无乳链球菌10 d后，各试验组罗非鱼的免疫保护率分别为21.56%、37.86%、56.41%和61.25%。在攻毒试验中，所有死亡罗非鱼均出现突眼、皮肤出血、腹部肿胀等症状，取刚死亡罗非鱼的脑、肝和肾进行了细菌分离鉴定，结果均为无乳链球菌。研究表明，投喂APS可以增强吉富罗非鱼抗无乳链球菌感染的能力，在饵料中添加0.15%~0.20%的APS对提高罗非鱼的抗病能力具有良好的效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.014.F004图4复方中草药对吉富罗非鱼免疫保护率的影响3讨论3.1黄芪多糖对吉富罗非鱼生长性能的影响在本试验中，饵料中添加适当比例的APS能显著提高吉富罗非鱼的生长性能。研究表明，在斑马鱼[11]、克氏原螯虾[12]、翘嘴鲌[13]等饵料中添加适量APS均显著提高了水产动物的生长性能，与本试验结果相似。黄芪多糖可通过提高消化酶活性等改善消化的方式增强动物的生长性能。Elabd等[14]研究发现，添加APS显著提高了尼罗罗非鱼的消化酶活性，从而显著促进了其生长。有研究表明，APS的抗菌活性和抗病毒等功效对肠道菌群产生了有益影响，这也是APS促进生长的原因之一[15]。APS提高免疫力也是机体能够快速生长的关键[16]。本研究中，罗非鱼的生长性能与APS添加水平的密切相关，过低和过高的添加剂量均对罗非鱼的生长无显著影响，因此吉富罗非鱼饵料中APS的适宜添加量为0.15%。3.2黄芪多糖对吉富罗非鱼免疫功能的影响在鱼类免疫系统中，相较于原始的特异性免疫系统，往往更依赖非特异性免疫系统发挥免疫功能。而LSZ、SOD、AKP等是鱼类血清中重要的非特异性免疫指标，常用于衡量鱼体的免疫力水平。LSZ通过分解细菌细胞壁上的肽聚糖杀灭细菌[17]；SOD是转化活性氧的关键酶，发挥抗氧化减少细胞损伤的作用[18]；AKP在动物生存与生长中具有重要作用[19]。近年来，Chang等[20]以凡纳滨对虾为试验对象，在基础日粮中添加比例为0.1、0.2、0.4、1.0 g/kg的APS饲喂30 d后，发现凡纳滨对虾血清SOD、LZM、ACP及AKP等活性明显提高，并建议最适添加量为0.2 g/kg。Elabd等[21]在蓝鳃太阳鱼饵料中添加0、1.5%、3.0%和4.5%的黄芪喂养8周，结果发现，蓝鳃太阳鱼的生长性能和SOD、过氧化氢酶等免疫酶活性显著提高。研究发现，在尼罗罗非鱼[14]、凡纳滨对虾[20]、刺参[22]等添加黄芪多糖能够提高机体免疫水平。本试验结果显示，从试验第7 d开始，试验组吉富罗非鱼血清中的AKP、SOD和LSZ活力呈升高趋势，酶活力在一定范围内随黄芪多糖的添加量增加而增强，表明黄芪多糖显著增强了罗非鱼抗菌、抗氧化及抗应激等功能。3.3黄芪多糖对吉富罗非鱼抗病力的影响无乳链球菌是罗非鱼链球菌病的主要病原菌之一[23]。病害暴发迅猛是罗非鱼养殖产业的最主要威胁之一，抗生素是目前主要的治疗手段。但药物残留又会产生环境污染和病菌耐药性等问题，因此需要开发绿色可持续的防治方法。近年来，黄芪多糖因其具备抗菌、抗病毒等免疫活性受到广泛关注。Shi等[15]使用含1 g/kg APS的饲料喂养草鱼8周，发现草鱼对嗜水气单胞菌的抵抗力明显提高。本试验发现，添加APS提高了吉富罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力。4结论本试验表明，在饵料中添加一定比例的黄芪多糖可以提高吉富罗非鱼生长性能、免疫力及对无乳链球菌的抵抗力，以0.15%添加水平效果较好。