青贮是我国北方畜牧业可持续发展的最有效保障[1]，也是饲草高质量保存的最有效手段[2]。青贮饲料在我国作为反刍动物重要的饲料来源，同时在欧美等发达地区也得到广泛应用[3]。青贮饲料备受关注，成为行业内研究热点[4-8]。但青贮饲料品质与行业需求不匹配。为提高青贮品质，市场上出现大量青贮添加剂，主要分为同型乳酸菌类、异型乳酸菌类、同型乳酸菌和异型乳酸菌复合剂类。虽然可以用来提高青贮品质的青贮添加剂很多，但在生产实践中由于取用过程中未能妥善管理，往往会造成二次发酵，降低青贮饲料品质[9]。不仅如此，即使在低pH值的青贮饲料中，也有一些酵母菌在厌氧繁殖阶段中通过将乳酸和糖类同化为乙醇而生长并引起营养损失[10]。Borreani等[11]发现，在有氧暴露期间干物质损失可能高达20％。为解决青贮开窖二次发酵导致的问题，在青贮玉米秸秆上尝试复合菌剂与酸化剂配合使用。酸化剂中包含己酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钠，均具有抗菌作用。由于农作物秸秆在自然条件下是1种劣质饲料[12]，本研究选择玉米秸秆作为青贮对象，将玉米秸秆调制成优质青贮饲料，提高其营养价值和适口性使其过腹转化增值，对促进玉米秸秆饲料化利用具有十分重要的现实意义。农作物秸秆的综合利用能够保护生态环境，节约再生能源，促进农业可持续发展[13]。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1复合菌液及酸化剂试验所用布氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌均由山东宝来利来生物工程股份有限公司提供，菌种浓度600亿CFU/g。酸化剂制备：将己酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钠溶于水中制成复合酸化剂，使其每升含有11 g己酸、257 g苯甲酸钠、134 g山梨酸钾和57 g丙酸铵。1.1.2青贮制备玉米籽粒2/3乳线期收割秸秆，切至2~3 cm，按试验设计将菌液、酸化剂均匀地喷洒在青贮原料上，填装压实并确保聚乙烯青贮袋边角充分压实，抽真空后再用收缩膜密封，25 ℃厌氧发酵90 d，得到青贮饲料。1.2仪器与设备KDN-103F自动定氮仪购自上海纤检仪器有限公司；TRACE™ 1300气相色谱仪购自赛默飞；HPX-9082MBE电热恒温培养箱购自上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2F超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；PB-10酸度计购自Sartorious。1.3试验方法1.3.1试验设计试验设对照组（CK，无添加）、复合菌剂试验组（LAB组，布氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌等比例添加，菌添加量105 CFU/g青贮原料）、复合菌剂+酸化剂试验组（LAB+组，在复合菌剂试验组基础上额外添加复合酸化剂10 mL/kg），每个聚乙烯青贮袋里填充4 kg玉米秸秆青贮饲料，每个处理设8个重复，抽真空后密封，在25 ℃条件下进行青贮。青贮90 d后，分别测定开袋后1、3、7、11 d的pH值、粗蛋白、干物质、乳酸、乙酸、丁酸、乳酸菌和酵母菌含量，并在有氧暴露每12 h分别取样分析有氧稳定性。1.3.2干物质量［14］取100 g青贮鲜样，置于65 ℃的烘箱中48 h至恒重，冷却后称重。干物质含量=(烘后干重-烘后袋重)/烘前鲜重×100%(1)1.3.3pH值测定根据青贮饲料理化品质评定标准[15]采用pH计测定pH值。1.3.4发酵产物测定利用凯氏定氮法测定粗蛋白含量。利用范氏法测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量。青贮中有机酸的提取[16]：称取5 g待测试样品置于离心管中，加入30 mL超纯水并加入H2SO4酸化使pH值小于2，盖紧盖子，于4 ℃浸提24 h，用气相色谱法[17]测定乳酸（LA）、乙酸（AA）、丁酸（BA）含量。取10 g青贮样品加入含有90 mL无菌水的三角瓶中，放入220 r/min摇床30 min，利用平板计数方法测定乳酸菌、酵母菌活菌数。乳酸乙酯（EL）和乙酸乙酯（EA）使用0.25 µm Optima Wax色谱柱（德国杜伦Macherey-Nagel）进行气相色谱测定[18]。1.3.5有氧稳定性测定［19］青贮有氧稳定性：每个重复中取出500 g样品放入聚乙烯塑料袋，用牙签扎出孔隙，放置于恒温隔热的塑料泡沫箱内，将温度记录仪插入青贮样品中心，每30 min记录1次。青贮有氧稳定性为青贮饲料中心温度比室温高2 ℃所需要的时间。2结果与分析2.1青贮玉米秸秆90 d发酵产物化学成分分析（见表1）青贮初始DM含量为35.25%。由表1可知，90 d时CK、LAB、LAB+处理干物质损失率分别为12.76%、3.37%、5.19%，添加复合菌剂降低DM损失效果最为显著（P0.05）。90 d时LAB、LAB+处理CP、LA、AA含量较CK均有显著提高（P0.05），但ADF差异不大（P0.05），而且与CK相比，LAB、LAB+处理明显降低NDF、EL、EA含量。LAB处理的CP、NDF、ADF、LA指标与LAB+处理无显著差异（P0.05），说明酸化剂对青贮的CP、NDF、ADF、LA含量影响不大。与CK相比，LAB、LAB+处理EL、EA含量显著降低（P0.05）。LAB+处理EL、EA含量明显低于LAB处理（P0.05），说明添加酸化剂更能限制EL、EA在青贮中的积累。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.019.T001表1青贮玉米秸秆90 d发酵产物化学成分分析项目CKLABLAB+DM/%28.70±2.11b34.2±2.13a33.4±1.09aCP/%7.84±0.21b9.14±0.33a9.54±0.18aNDF/%60.82±2.83a50.74±3.48b52.26±2.58bADF/%37.11±2.14a35.76±1.95a34.60±1.21aLA/(g/kg)2.1±0.37b3.59±0.12a3.62±0.09aAA/(g/kg)0.94±0.02c1.71±0.08a1.44±0.11bEL/(mg/kg)334.63±30.55a271.55±24.89b194.26±16.5cEA/(mg/kg)508.21±35.61a426.84±24.11b374.6±19.58c注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P0.05)，相同字母表示差异不显著（P0.05）。2.2复合菌剂及酸化剂对有氧暴露期间青贮中乳酸菌和酵母菌数量的影响（见表2）由表2可知，LAB、LAB+处理的乳酸菌数量显著高于CK处理（P0.05），酵母菌数量显著低于CK处理（P0.05），LAB和LAB+处理之间乳酸菌数量无明显差异（P0.05），但复合菌剂和酸化剂协同作用显著减少酵母菌数量（P0.05）。随有氧暴露天数增加，青贮中乳酸菌菌数量逐渐减少，酵母菌数量增多。与有氧暴露0 d时相比，CK、LAB、LAB+处理11 d时乳酸菌数量分别减少69.87%、52.47%、40%。LAB处理在1 d时，酵母菌数量显著低于CK处理（P0.05），3、7、11 d时与CK处理酵母菌数量之间差异不显著（P0.05）。LAB+处理在7 d时酵母菌数量仍显著低于CK、LAB处理（P0.05），11 d时，三者之间酵母菌数量无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.019.T002表2复合菌剂及酸化剂对有氧暴露期间青贮中乳酸菌和酵母菌数量的影响项目组别有氧暴露天数/d013711乳酸菌/(lg CFU/g FW)CK6.87±0.26b6.82±0.15c7.17±0.08b4.23±0.11c2.07±0.02cLAB7.49±0.12a8.04±0.12a8.24±0.19a5.87±0.04b3.56±0.09bLAB+7.40±0.09a7.83±0.33b8.15±0.22a6.17±0.06a4.44±0.08a酵母菌/(lg CFU/g FW)CK5.39±0.11a6.58±0.08a7.14±0.37a7.33±0.32a7.82±0.34aLAB2.08±0.23b5.02±0.05b6.51±0.30a7.07±0.19a7.53±0.21aLAB+1.07±0.09c4.37±0.04b6.09±0.12b6.21±0.12b7.17±0.25a注：同列同项目数据肩标不同字母表示差异显著(P0.05)，相同字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3复合菌剂及酸化剂对青贮有氧稳定性及有氧暴露后pH值的影响（见图1、图2）由图1可知，LAB+和LAB处理的有氧稳定性均高于CK处理，特别是添加酸化剂后提升效果显著（P0.05）。说明酸化剂可以大大延长青贮有氧暴露后的贮藏时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.019.F001图1复合菌剂及酸化剂对青贮有氧稳定性的影响由图2可知，在青贮与空气接触后，0~3 d时各处理pH值变化趋于平缓，3 d后pH值开始快速上升，其中LAB+处理在0~11 d过程中pH值均处于最低水平，在到达11 d时pH值显著低于其他处理（P0.05），进一步证明添加酸化剂可以更好地提高青贮有氧稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.019.F002图2复合菌剂及酸化剂对有氧暴露后青贮pH值的影响2.4有氧暴露期间有机酸含量动态变化（见表3）由表3可知，0 d时，LAB、LAB+处理乳酸、乙酸含量显著高于CK处理（P0.05）。LAB处理的乳酸含量与LAB+处理差异不大（P0.05），但乙酸含量显著高于LAB+处理（P0.05）。添加复合菌剂和酸化剂的试验组中未检测到丁酸，CK组中含有较少的丁酸。说明添加复合菌剂可以有效提高青贮中乳酸和乙酸含量，抑制丁酸产生，但复合菌剂与酸化剂配合使用显著减少青贮中的乙酸含量（P0.05）。随有氧暴露时间增加，青贮中的乳酸、乙酸不断减少，而丁酸含量不断增加，但在有氧暴露11 d内，试验组乳酸、乙酸含量总是显著高于对照组，7、11 d时LAB+处理的乳酸、乙酸含量大于显著LAB处理（P0.05）。说明青贮接触空气后，添加复合菌剂会与酸化剂配合使用，大大降低乳酸、乙酸损失。LAB+处理直至有氧暴露第3 d才检测到丁酸存在，说明复合菌剂与酸化剂互作对抑制丁酸生成有显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.019.T003表3复合菌剂及酸化剂对有氧暴露0~11 d青贮中有机酸含量的影响项目组别有氧暴露天数/d013711乳酸/(% DM)CK2.10±0.37b2.02±0.01b1.46±0.02d0.19±0.00c—LAB3.59±0.12a3.19±0.12a2.87±0.03a1.56±0.09b0.36±0.06bLAB+3.62±0.09a3.27±0.12a2.94±0.08a1.85±0.04a0.52±0.02a乙酸/(% DM)CK0.94±0.02c0.85±0.02b0.39±0.03b0.06±0.00c—LAB1.71±0.08a1.65±0.05a0.93±0.07a0.40±0.00b0.07±0.00bLAB+1.44±0.11b1.37±0.07b1.02±0.06a0.66±0.01a0.19±0.01a丁酸/(% DM)CK0.06±0.000.11±0.000.14±0.00a0.19±0.00a0.24±0.01aLAB——0.02±0.00b0.05±0.00b0.11±0.00bLAB+———0.03±0.00b0.07±0.00c注：“—”为含量低于检测线，未检测出目标存在。2.5有氧暴露期间粗蛋白、干物质含量动态变化（见图3、图4）由图3可知，有氧暴露11 d内，各处理粗蛋白含量呈下降趋势，CK、LAB、LAB+各处理11 d时粗蛋白含量较0 d时分别降低5.48%、13.23%、15.72%。虽然在有氧暴露期间，LAB+、LAB处理粗蛋白含量损失更大，但LAB+、LAB处理粗蛋白含量在0~11 d仍高于CK处理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.019.F003图3有氧暴露期间青贮粗蛋白含量变化由图4可知，有氧暴露11 d内，CK、LAB、LAB+各处理11 d时干物质含量比0 d时分别降低10.85%、6.94%、4.63%，且LAB+、LAB处理粗蛋白含量在0~11 d显著高于CK处理（P0.05），但LAB处理和LAB+处理之间差异不大（P0.05）。说明复合菌剂及酸化剂可以有效减少有氧暴露期间干物质损失。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.019.F004图4有氧暴露期间青贮干物质含量变化3讨论本研究中，复合菌剂+酸化剂处理有氧暴露0~11 d内pH值始终低于复合菌剂处理，特别在3 d后差异达显著水平。pH值是衡量青贮优良与否的重要指标之一。pH值越低对腐败菌抑制效果越好，因此酸化剂中各成分在青贮中可以发挥重要抑菌作用，己酸具有两亲性结构，该结构可溶解细菌细胞膜并由于对电子传输链的干扰而扰乱氧化磷酸化过程，因而具有抗菌作用[20]。苯甲酸钠具有广谱抗微生物作用，会随着介质酸度的增高其杀菌、抑菌效力增强；山梨酸钾有很强的抑制腐败菌和霉菌的作用在酸性介质中能充分发挥防腐作用；丙酸铵在酸性条件下产生游离丙酸，对各类霉菌、革兰氏阴性杆菌有较好的抑菌效果。pH值在开窖后回升，这是由于大量空气涌入给予腐败菌、酵母菌等良好的生存繁殖机会，乳酸、乙酸被好氧微生物分解代谢，乳酸和乙酸含量逐渐减少，进而导致pH值升高[21]。但在青贮中添加酸化剂明显抑制pH值在有氧暴露3~11 d上升趋势。从有氧暴露期间菌群变化来看，3~11 d时LAB+处理的乳酸菌数量显著高于LAB处理，3~7 d时LAB+处理酵母菌数也明显低于LAB处理。同时，复合菌剂与酸化剂配合使用，还大大降低有氧暴露期间乳酸、乙酸损失，延缓丁酸生成。最终，通过有氧稳定性检测，与LAB处理相比，LAB+处理显著提高青贮有氧稳定性。在青贮玉米中添加乳酸菌菌剂可显著提高DM含量[22]。本研究中，90 d青贮后发现，添加乳酸菌处理的DM含量显著高于对照组，原因在于添加乳酸菌促进青贮前期乳酸发酵，加速青贮内环境的酸化，进而抑制有害微生物的活性，从而减少DM损失[23]。青贮中添加复合菌剂和酸化剂，与复合菌剂处理相比，虽然在DM、NDF、ADF、CP、LA指标上无显著差异，但显著降低EL、EA。有研究表明，青贮饲料中挥发性有机物不仅可能会产生异味，有造成空气污染的风险[24]，还不利于反刍动物的采食量及新陈代谢[10]。添加酸化剂有效抑制乙酸乙酯、乳酸乙酯的积累，预防环境污染风险，提高青贮适口性。在有氧暴露期间，各处理CP、DM含量不断降低。苗芳[25]研究发现，在有氧暴露期间青贮干物质量先升高后降低，究其原因是乳酸菌减缓全株玉米青贮的有氧腐败，青贮渗出液的流失导致青贮中的含量相对增加。本研究使用聚乙烯青贮袋封存青贮，开袋后无汁液流出袋外，因此CP、DM含量均处于下降趋势。由于LAB、LAB+处理青贮90 d时CP含量显著高于CK处理，导致CK、LAB、LAB+各处理11 d时粗蛋白含量较0 d时分别降低5.48%、13.23%、15.72%，虽然在有氧暴露期间，LAB+、LAB处理粗蛋白含量损失更大，但LAB+、LAB处理粗蛋白含量在0~11 d仍高于CK处理。而CK、LAB、LAB+各处理11 d时干物质含量比0 d时分别降低10.85%、6.94%、4.63%，说明复合菌剂及酸化剂在有氧暴露过程中减缓CP的损失效果明显。4结论与对照相比，复合菌剂处理、复合菌剂+酸化剂处理均显著提高青贮玉米秸秆饲料的发酵品质且复合菌剂处理、复合菌剂+酸化剂处理之间差异未达显著水平。与复合菌剂处理相比，复合菌剂+酸化剂处理有氧稳定显著提高，明显减少有氧暴露期间粗蛋白损失。综上所述，在青贮中配合施用复合菌剂与酸化剂，既保证青贮发酵品质，又能提高青贮有氧稳定性，是良好的青贮添加剂组合。