微生态制剂是利用微生物学原理，将微生物菌体从自然环境中筛选出来，选用对宿主有利无害的益生菌或益生菌促生长物质，经过特殊的加工工艺培养和传代繁殖后，制成含有大量益生菌且对宿主起到有益作用的活菌制剂[1]。微生态制剂作为一种无残留、无污染的天然饲料添加剂，可以很好地作为抗生素及抗菌类药物的替代品，应用到畜禽养殖生产中可以为消费者提供绿色、安全的动物产品。目前，制作微生态制剂所选用的益生菌按照菌种类型分可分为芽孢杆菌类、乳酸菌类、酵母菌类和光合细菌等。相对大多数微生态制剂，酵母菌类微生态制剂具有其独特的自然风味、适口性好、耐酸性强、可回收利用率高等特点，在动物体内生长速度快，对抗生素具有天然的耐受能力[2]。研究表明，酵母菌类微生态制剂可以有效维持动物消化道内的微生态菌群平衡，增强畜禽胃肠道蠕活力，加快摄入营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，提升畜禽机体的免疫系统机能，达到预防畜禽疾病、改善胃肠道功能、提高综合生产性能等目的[3-5]。因此，试验对1株热带假丝酵母菌的固态发酵培养基及发酵条件进行优化，分析不同营养物质成分及发酵条件对热带假丝酵母菌固态发酵品质的影响，旨在为高效制备及推广应用此类酵母菌制剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株试验所使用的热带假丝酵母（Candida Tropicalis）由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所微生物研究室提供（保藏号：YR1）。1.1.2试验仪器与设备HH-6恒温水浴锅购自金坛市杰瑞尔电器有限公司；HZQ-F280恒温振荡培养箱购自常州金坛精达仪器制造有限公司；CX23生物显微镜购自奥林巴斯公司；血球计数板购自上海市求精生化试剂仪器有限公司。1.1.3基础培养基配制YPD液体培养基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌30 min备用。YPD琼脂培养基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌30 min备用。基础固态发酵培养基：麸皮8 g、玉米粉1 g、豆粕1 g，121 ℃高压灭菌30 min备用。1.2试验方法1.2.1热带假丝酵母菌生长曲线的测定试验采用比浊法测定热带假丝酵母菌生长曲线。选取活化后长势良好的完整菌落，接种至50 mLYPD液体培养基中，在恒温条件下30 ℃、180 r/min振荡培养48 h，每4 h取样1次，在波长600 nm条件下，分别测定不同时间段酵母菌的OD值，绘制生长曲线。1.2.2发酵活菌数的测定试验采用稀释血球计数法测定热带假丝酵母菌固态发酵活菌数。1.3固态发酵条件单因素优化试验研究1.3.1不同发酵时间对菌株发酵的影响将菌株接种到基础固态发酵培养基中，以30 ℃、接种量5%（v/m）、料水比1∶1、自然pH值为起始发酵条件下进行培养，分别比较不同发酵时间（36、48、60、72、84、96 h）对菌株活菌数的影响，最终确定热带假丝酵母菌株的最佳发酵时间。1.3.2不同接种量对菌株发酵的影响在30 ℃、料水比1:1、自然pH值条件下培养48 h，分别比较不同接种量（v/m）（1%、3%、5%、7%、9%、11%）对菌株活菌数的影响，最终确定热带假丝酵母菌株的最佳发酵接种量。1.3.3不同料水比对菌株发酵的影响在30 ℃、接种量11%、自然pH值条件下培养48 h，分别比较不同料水比（1∶0.75、1∶1.00、1∶1.25、1∶1.50、1∶1.75、1∶2.00）对菌株活菌数的影响，最终确定热带假丝酵母菌株的最佳发酵料水比。1.4固态发酵培养基单因素优化试验研究1.4.1不同碳源种类对菌株发酵的影响试验以1 g玉米粉等量的碳元素含量为标准，选取葡萄糖、甘油、糖蜜、处理玉米粉为工艺优化因素，依次替换基础固态培养基中的玉米粉。在已经确定好的固态发酵条件下，分别比较不同碳源种类对菌株活菌数的影响，最终确定热带假丝酵母菌株的最佳培养基碳源种类。1.4.2不同氮源种类对菌株发酵的影响将基础固态发酵培养基中的玉米粉替换为甘油。以1 g豆粕等量的氮元素含量为标准，选取蛋白胨、硫酸铵、尿素、处理豆粕为工艺优化因素，依次替换基础固态培养基中的豆粕，分别比较不同氮源种类对菌株活菌数的影响，最终确定热带假丝酵母菌株的最佳培养基氮源种类。1.4.3不同碳源添加量对菌株发酵的影响以1%尿素添加量为氮源，分别比较不同麸皮与甘油（g）添加量（10.0∶0、9.5∶0.5、9.0∶1.0、8.5∶1.5、8.0∶2.0）对活菌数的影响，最终确定热带假丝酵母菌株最佳碳源添加量。1.4.4不同氮源添加量对菌株发酵的影响以麸皮与甘油8.5∶1.5（g/g）的添加量为碳源，分别比较不同尿素添加量（0、0.5%、1%、1.5%、2%）对活菌数的影响，确定热带假丝酵母菌株最佳氮源添加量。1.4.5不同无机盐添加量对菌株发酵的影响以最佳碳、氮源种类及添加量为基础，在固态培养基中分别添加不同剂量（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%）的磷酸二氢钾（KH2PO4），比较不同KH2PO4的添加量对菌株活菌数的影响，最终确定热带假丝酵母菌株最佳无机盐添加量。1.5正交优化试验研究根据以上单因素优化试验结果，确定甘油、尿素、磷酸二氢钾、料水比4个因素，设置4因素3水平正交试验，每组试验因素设定3个水平，以期获得热带假丝酵母菌的最佳固态发酵培养基组分及发酵条件。正交试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.T001表1正交试验L9（34）水平表水平A甘油/gB尿素/%C磷酸二氢钾/%D料水比19.0∶1.00.00.01.00∶0.7528.5∶1.50.50.21.00∶1.0038.0∶2.01.00.41.00∶1.251.6对比验证试验将试验菌株接种到最优固态发酵培养基上，在最佳发酵条件下进行培养，从而测定其发酵产物的活菌数，与优化前作对比。2结果与分析2.1热带假丝酵母菌生长曲线（见图1）由图1可知，菌株在0~12 h期间处于生长对数期阶段，曲线呈现快速上升态势，菌体生长速度快，活力较为旺盛。菌株在12~36 h期间，曲线上升趋势趋于平稳，说明菌株在此阶段生长速度开始放缓，逐步进入稳定期阶段。在36 h以后，菌株生长逐渐进入衰退期，生长曲线出现下降趋势。因此，试验最终选择12 h为热带假丝酵母菌固态发酵种子液的最佳培养时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F001图1热带假丝酵母菌生长曲线2.2不同发酵时间对热带假丝酵母菌活菌数的影响（见图2）由图2可知，随着发酵时间的不断延长，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数不断增加，当发酵时间为48 h时，固态发酵活菌数数量达到16.26×108个/g，之后随着发酵时间的延长，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数呈下降趋势。因此，确定48 h为热带假丝酵母菌最佳固态发酵时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F002图2不同发酵时间对热带假丝酵母菌活菌数的影响2.3不同接种量对热带假丝酵母菌活菌数的影响（见图3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F003图3不同接种量对热带假丝酵母菌活菌数的影响由图3可知，当菌株接种量为11%时，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数可达到15.21×108个/g。因此，菌株接种量为11%时，可以作为热带假丝酵母菌最佳接种量。2.4不同料水比对热带假丝酵母菌活菌数的影响（见图4）由图4可知，随着水分添加量的升高，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数也不断增加，当料水比为1∶1时，固态发酵活菌数达到12.55×108个/g，之后热带假丝酵母菌固态发酵活菌数随着水分的升高而降低。因此，热带假丝酵母菌最佳料水比为1∶1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F004图4不同料水比对热带假丝酵母菌活菌数的影响2.5不同碳源种类对热带假丝酵母菌活菌数的影响（见图5）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F005图5不同碳源种类对热带假丝酵母菌活菌数的影响由图5可知，当甘油为碳源时，菌株活菌数量达到最高，为26.07×108个/g，而其他几种碳源对热带假丝酵母菌固态发酵活菌数的生长水平影响较低。因此，确定甘油为热带假丝酵母菌最佳碳源种类。2.6不同氮源种类对热带假丝酵母菌活菌数的影响（见图6）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F006图6不同碳源种类对热带假丝酵母菌活菌数的影响由图6可知，当氮源为尿素时，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数达到最高值，为32.19×108个/g。因此，最终确定尿素为热带假丝酵母菌最佳氮源种类。2.7不同碳源添加量对热带假丝酵母菌活菌数的影响（见图7）由图7可知，随着甘油添加量（麸皮∶甘油）的不断提高，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数呈先升后降趋势。当甘油添加量为8.5∶1.5时，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数达到最高值，为22.61×108个/g；当甘油添加量为8∶2时，其固态发酵活菌数出现下降趋势，为22.09×108个/g。因此，确定甘油添加量8.5∶1.5为热带假丝酵母菌固态发酵的最佳碳源添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F007图7不同甘油添加量对热带假丝酵母菌活菌数的影响2.8不同氮源添加量对热带假丝酵母菌活菌数的影响（见图8）由图8可知，当尿素添加量为0时，其活菌数含量较高，为23.73×108个/g；当尿素添加量为0.5%时，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数达到最高，为28.97×108个/g。之后，随着尿素添加量的不断加大，培养基中的内环境发生改变，菌株的正常生长繁殖受到极大的抑制，从而导致菌株活菌数繁殖数量急剧下降。因此，热带假丝酵母菌固态发酵最佳氮源添加量应为0.5%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F008图8不同尿素添加量对热带假丝酵母菌活菌数的影响2.2.5磷酸二氢钾添加量对热带假丝酵母菌活菌数的影响由图9可知，随着磷酸二氢钾添加量的不断加大，固态发酵活菌数呈先扬后抑趋势。当磷酸二氢钾添加量为0.2%时，热带假丝酵母菌固态发酵活菌数达到最高值，为27.55×108个/g。可见，热带假丝酵母菌固态发酵最佳无机盐添加量0.2%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.F009图9不同磷酸二氢钾添加量对热带假丝酵母菌活菌数的影响2.3正交优化试验结果（见表2、表3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.T002表2热带假丝酵母菌正交优化试验结果试验号A甘油B尿素C磷酸二氢钾D料水比活菌数/(×108个/g)1111127.112122230.963133321.354212317.065223138.006231234.817313223.958321326.899332133.89k126.47322.70729.60333.000k229.95731.95027.30329.907k328.24330.01727.76721.767R3.4849.2432.30011.233较好水平A2B2C1D1因素主次3241由表2可知，影响热带假丝酵母菌发酵水平主次因素关系为：DBAC（料水比尿素甘油KH2PO4），因素间最佳水平组合为A2B2C1D1，即热带假丝酵母菌菌株最佳固态发酵培养基组成成分为：甘油添加量（g）∶8.5∶1.5，尿素添加量0.5%，KH2PO4添加量0，料水比1∶0.75。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.T003表3方差分析因素偏差平方和自由度均方F值Sig值甘油49.65224.8252.6940.095尿素319.8632159.93117.3530.001*磷酸二氢钾21.141210.571.1470.340料水比447.5022223.75124.2780.000*误差165.89189.216校正后总计1 004.04626注：*表示影响显著（P＜0.05）由表3可知，在固态发酵培养基中，料水比和尿素两个因素会显著影响热带假丝酵母菌的发酵水平，甘油、磷酸二氢钾影响菌株发酵水平次之。2.4验证对比试验结果（见表4）根据正交试验得出的最佳培养基，在最佳发酵条件下对热带假丝酵母菌进行验证试验。由表4可知，热带假丝酵母菌在优化后，固态发酵活菌数可达到32.94×108个/g，比优化前提高2.26倍。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.014.T004表4热带假丝酵母菌验证对比试验结果项目优化前优化后提高倍数活菌数/（×108个/g)14.5632.942.263讨论3.1影响酵母菌生长的发酵条件因素本试验表明，发酵时间、接种量、料水比等生长环境条件因素对菌株的生长效果起着非常重要的作用。发酵时间可直接影响着菌株生长繁殖的活力。发酵时间较短，菌株不能充分利用培养基中的营养物质，导致菌株不能充分生长繁殖；发酵时间过长，菌株会将培养基中的营养物质消耗殆尽，从而导致菌株开始出现生长停滞、老化并且趋于死亡，使得菌株的生物量和发酵产物产量显著降低。固态发酵法的发酵周期较长，所以在发酵过程中，应选取适宜菌种快速生长的时间段，既可以避免时间的浪费，又可以大大提高菌种的繁殖数量。试验发酵菌株在48 h时，其发酵活菌数达到最高，这一结果与王岩[6]、陆娟等[7]和谢全喜等[8]的研究结果相一致。接种量是指待接种的发酵种子液与固态培养基质的体积比例，待接种菌液的多少决定着生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度的快慢。固态发酵时，选取接种到培养基质中的菌液为对数期生长阶段的发酵菌液，其培养时间较短，生长活力还没得到充分释放。接种量过少，会延缓菌株在培养基质中的生长速度，促使其他杂菌任意滋生，影响菌数的产量；接种量过大，会加快菌株的繁殖速度和产生代谢废物量，急剧培养环境中能量的消耗，过度释放热量，破坏菌株的生长环境，抑制其正常生长，不仅对资源造成浪费，而且也提高发酵成本。所以要根据不同菌株的生理特性来确定接种量的大小，适量的添加才能在培养基中形成优势菌体大量繁殖。料水比是影响微生物发酵的重要因素。在固态发酵过程中对培养基中的水分含量要求极为严格，菌株更好的生长繁殖是因为有水分的存在。但是，如果水分含量过高，会使得发酵底物呈现黏稠状，菌株无法更多的摄取到养分，同时还会影响菌株与发酵物料之间的透气性和通氧量，使得发酵物料散热性下降，促进培养基中的厌氧菌及杂菌大量滋生，与菌株争夺营养物质，抑制其正常生长繁殖，污染整个培养基，使其发酵失败；水分含量过低，菌液不能均匀的附着在物料表面，使菌种难以充分利用营养物质，抑制其生长代谢，降低菌数含量及其代谢产物。试验中，菌株通过单因素和正交优化试验可以看出，料水比对改变菌株活菌数含量作用明显。3.2培养基组分对酵母生长的影响培养基是结合不同营养物质配制而成的营养基质，主要是为微生物正常生长繁殖、代谢及合成产物提供相应的营养物质，也是微生物生长繁殖的场所。在选择不同类型的培养基过程中，应按照不同微生物的生长特性来进行选择，但绝大多数的培养基组成成分基本上都含有碳源、氮源、水分、无机盐等营养物质。微生物在生长过程中除培养基中的水分外，碳源是构成菌体细胞的重要元素，同时也是影响菌株繁殖最大的一类营养物质，可以为菌株的正常生长繁殖提供其所必需的营养物质基础。碳源的种类较多且广泛分布于自然界中，不同类型的菌株对其利用的效果也不尽相同。试验中，以等质量的碳元素含量为标准，通过对玉米粉、葡萄糖、甘油、糖蜜、处理玉米粉5种碳源进行筛选后发现，当甘油作为固态培养基中的碳源时，其菌株发酵活菌数数量明显提高，且高于其他几种碳源种类，说明明试验菌株利用甘油的效能要优于其他几种所选碳源。甘油作为工业副产品，产量较大、成本较低，适合大规模生产使用，所以选择其作为最佳碳源尤为合适。这一试验结果与张良[9]、李亮[10]、孙荣等[11]研究相一致。作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物材料的氮源，其营养基质重要性仅次于碳源，通常培养基中的氮源种类大致被分为两大类，即有机氮源（牛肉膏、花生豆饼、蛋白胨等）和无机氮源（尿素、硝酸铵、氨水等）。研究表明，无机氮源对微生物的生长代谢效果要劣于有机氮源。但钱伟等[12]在优化黑曲霉固态发酵产柚苷酶培养基试验中发现，培养基中的氮源分别选用尿素、硫酸铵、硝酸铵等无机氮源时，菌株产柚苷酶的酶活均高于选用蛋白胨等有机氮源的活性。刘明启等[13]以黑曲霉为目标菌株，添加不同类型的氮源后发现，菌株利用无机氮源所生产出的木聚糖酶的活性明显优于有机氮源，且选用硫酸铵的效果最佳。郭维烈等[14]报道，当发酵培养基中的氮源种类选用为无机氮源时，其发酵效果要优于有机氮源。彭凯等[15]研究发现，在利用不同氮源对酒精进行发酵试验中，当氮源选择为尿素时，发酵培养基中的还原糖含量可大幅降低，发酵时间可明显缩短，同时酵母菌活菌数数量增加明显且可以提前到达峰值，其发酵效果明显优于其他种类的氮源。黄兴国等[16]在多菌固态发酵啤酒糟生产饲用微生态制剂工艺研究中得出，有益菌活菌总数的多少与培养基质中添加尿素、硫酸铵两种物质存在密切的相关性，可显著提升发酵活菌数量。本试验中，选用尿素为固态发酵培养基的最佳氮源时，菌株活菌数均高于其他有机氮源种类，且对菌株的生长活性影响较大，与上述研究者的结论相一致。4结论经过采用单因素优化试验及正交试验，得到适用于热带假丝酵母菌固态发酵条件为：温度30 ℃、接种量11%、料水比1.00∶0.75，自然pH值条件下恒温培养菌株48 h；固态发酵培养基成分为：麸皮与甘油（g）8.5∶1.5、尿素0.5%、磷酸二氢钾0%。依照此发酵工艺进行发酵，菌株活菌数可达32.94×108个/g，比优化前提高2.26倍。