水牛乳营养丰富、品质优良，是世界乳业的重要组成部分，其所含的脂肪、蛋白质、干物质总量明显高于普通奶牛乳，其综合营养价值是荷斯坦牛的近两倍[1-2]。因此，水牛乳在民间有“奶中之王”的美称[3]。德宏奶水牛是利用印度摩拉水牛或巴基斯坦的里尼-拉菲水牛与德宏水牛杂交育成的乳、肉、役兼用型水牛，杂交改良后的德宏奶水牛，产乳性能已得到较大提高[4]，是研究高乳脂含量相关优质基因的理想模型。溶质携带家族27（solute carrier family 27，SLC27）是一类结构完整的跨膜蛋白，又称脂肪酸转运蛋白（fatty acid transport proteins，FATPs），分子量60～83 kD，是具有至少一个跨膜结构域的整合膜蛋白。FATPs是由Schaffer等[5]在小鼠脂肪细胞上首次发现，当LPL基因过表达时，该组细胞对长链脂肪酸（long chain fatty acid，LCFA）的摄取能力明显提高，推测该蛋白可能是LCFA的跨膜转运载体，因此将其命名为脂肪酸转运蛋白。FATP1是FATPs蛋白家族中发现最早的蛋白，关于其跨膜转运脂肪酸（fatty acid，FA）作用机理的研究，Lewis等[6]提出两种作用机制的设想：一是FATP1由细胞膜磷脂直接与疏水性LCFA接触，促进LCFA穿过细胞膜；二是FATP1通过细胞表面一种转运复合物的方式帮助形成孔隙来介导FA的转运。在脂肪组织中FATP1可能与长链脂酰CoA合成酶（long-chain acyl-CoA synthetase 1，ACSL1）相互作用共同促进LCFA的摄取和转运[7]。研究通过荧光定量PCR法研究FATP1基因在不同乳脂率德宏奶水牛乳腺组织中mRNA的表达情况，并与乳脂率和FA含量进行相关性分析，以期进一步阐明FATP1基因在FA摄取和转运中的作用，并对德宏奶水牛乳用性能的选育提供参考。1材料与方法1.1试验动物选取216头德宏奶水牛，采集奶样，利用乳成分分析仪测定乳脂率。德宏奶水牛乳脂率为（7.5±0.5）%。其中，乳脂率为7%~8%的确定为中乳脂率组（M组），乳脂率高于8%的为高乳脂率组（H组），乳脂率低于7%的为低乳脂率组（L组）。选取养殖小区中饲养条件相同、同一胎次、年龄相近、处于泌乳盛期的不同乳脂率的健康德宏奶水牛各3头，采集乳样进行乳成分分析，采集乳腺组织，置于液氮中运回实验室，用于基因表达水平测定。1.2试验试剂RNAiso Plus RNA提取试剂、Prime Script TM reagent Kit Perfect Real Time、SYBR® Premix Ex Taq™ II均购自TaKaRa公司；RNA Fixer组织RNA保存液购自艾德莱生物科技有限公司。1.3试验仪器iCycler Thermal Cycler荧光定量PCR仪、Power PacTM Basic电泳仪、GelDocTM XR凝胶成像系统购自Bio-Rad公司；SW-CJ-IF超净工作台购自上海博迅实业有限公司；Thermo Biofuge Primo R高速冷冻离心机购自Thermo科技有限公司；Milko ScanTM FT120乳品分析仪购自上海技越国际贸易有限公司；GC-2014岛津气相色谱仪购自岛津企业管理有限公司。1.4德宏奶水牛乳成分分析1.4.1乳脂率测定采用Milko ScanTM FT120乳成分分析仪测定水牛乳的乳脂率。1.4.2脂肪酸含量测定采用岛津GC-2014气相色谱仪测定水牛乳中的FA含量。1.5乳腺组织总RNA的提取及反转录采用TRIzol法提取乳腺组织样品中的总RNA，采用微量核酸蛋白检测仪检测总RNA浓度和纯度，反转录合成cDNA，-80 ℃保存备用。1.6引物设计与合成根据NCBI上提供的水牛FATP1（NW_005785166.1）目的基因序列和β-肌动蛋白（β-actin, ACTB）（XM_006044278）内参基因序列，利用Primer 6.0计引物，采用Oligo 7.0进行评价，选择评分高的引物进行试验，引物由昆明硕擎生物科技有限公司合成。引物信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T001表1FATP1与β-actin基因引物信息引物名称引物序列（5'-3'）产物大小/bp退火温度/℃FATP1F：GCATGGATGATCGACTCTTCR：GTACTTGACGCAGTCATCC27258β-actinF：AAGGACCTCTACGCCAACACGR：TTTGCGGTGGACGATGGAG249601.7实时荧光定量PCR检测FATP1基因表达水平荧光定量染料采用SYBR Green Ⅱ，反应体系设置为20 µL，对FATP1基因表达量进行检测，每个样品设置3个平行来缩小系统误差，采集数据。1.8数据统计与分析试验数据采用SPSS 26.0单因素方差分析显著性，结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。利用Pearson相关系数法对目的基因mRNA表达水平与乳脂率和FA含量分别进行相关性分析。2结果与分析2.1德宏奶水牛乳成分测定2.1.1德宏奶水牛乳中的乳脂率（见表2）由表2可知，H组德宏奶水牛乳中乳脂含量极显著高于M组和L组（P0.01），M组乳脂含量又显著高于L组德宏奶水牛（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T002表2德宏奶水牛乳中的乳脂率（n=3）项目H组M组L组乳脂率9.16±0.53A7.44±0.52Ba6.72±0.67Bb注：同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P0.01），小写字母不同表示差异显著（P0.05），小写字母相同表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.1.2德宏奶水牛乳中的脂肪酸含量（见表3）由表3可知，德宏奶水牛乳中的总脂肪酸含量H组最高，L组最低，随着乳脂率的降低总脂肪酸含量也降低。水牛乳中总脂肪酸含量H组极显著高于M组和L组（P0.01），M组含量显著高于L组（P0.05）。德宏奶水牛乳中的长链脂肪酸（LCFA）含量H组最高，L组最低，且随着乳脂率的降低长链脂肪酸含量也降低。H组水牛乳中的长链脂肪酸含量极显著高于M组和L组（P0.01），M组的长链脂肪酸含量显著高于L组（P0.05）。德宏奶水牛乳中的不饱和脂肪酸（UFA）含量H组最高，L组最低。H组水牛乳中UFA含量极显著高于L组（P0.01），显著高于M组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T003表3德宏奶水牛乳中的脂肪酸含量（n=3）项目H组M组L组总脂肪酸5.53±0.52A3.73±0.25Ba3.48±0.33Bb长链脂肪酸4.42±0.47A3.55±0.22 Bb2.99±0.28Bc不饱和脂肪酸2.08±0.21Aa1.52±0.16ABb1.27±0.12Bbg/L2.2乳腺组织总RNA检测（见图1）提取9头德宏奶水牛乳腺组织中总RNA后，用1%左右的琼脂糖凝胶进行电泳检测。由图1可清晰观察到28 S和18 S条带清晰、明亮，说明得到的总RNA完整性较好，达到RNA质量要求。用微量核酸定量仪检测其浓度和纯度，OD260/280 nm值在1.8~2.2之间，纯度较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F001图1德宏奶水牛乳腺组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果注：M为DL-2000 Marker；1~3为H组；4~6为M组；7~9为L组。2.3FATP1基因mRNA表达水平（见图2）由图2可知，H组的表达量最高，L组的表达量最低，通过单因素方差分析表明，德宏奶水牛乳腺组织中FATP1基因mRNA表达水平H组极显著高于L组（P0.01），与M组无显著差异（P0.05），而M组与L组德宏奶水牛FATP1基因mRNA表达水平也无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F002图2德宏奶水牛乳腺组织中FATP1基因表达水平注：图中大写字母不同表示差异极显著（P0.01），小写字母不同表示差异显著（P0.05），小写字母相同表示差异不显著（P0.05）。2.4FATP1基因表达水平与乳成分相关性分析2.4.1乳脂率与乳中脂肪酸含量相关性分析（见表4）由表4可知，乳脂率与乳中总脂肪酸、长链脂肪酸含量和不饱和脂肪酸含量呈极显著正相关（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T004表4乳脂率与乳中脂肪酸的含量相关性分析项目总脂肪酸长链脂肪酸不饱和脂肪酸乳脂率0.940**0.950**0.855**注：数据肩标“**”表示差异极显著（P0.01）；下表同。2.4.2 FATP1基因表达水平与乳成分相关性分析（见表5）由表5可知，FAPT1 mRNA表达量与乳脂率、乳中总脂肪酸含量、长链脂肪酸含量和不饱和脂肪酸含量呈极显著正相关（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T005表5FATP1基因表达水平与乳成分相关性分析项目乳脂率总脂肪酸含量长链脂肪酸含量不饱和脂肪酸含量FATP10.914**0.816**0.856**0.813**3讨论乳脂的主要成分是脂肪，约占乳中脂质的98%。脂肪主要由α-磷酸甘油和FA合成。根据FA碳链的长度，可将FA分为短链脂肪酸、中链脂肪酸和长链脂肪酸；根据脂肪酸碳链中的双键，可将FA分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。乳中短链脂肪酸和中链脂肪酸主要是通过乳腺细胞的从头合成和从血液中直接摄取2种途径获得，LCFA的主要来源于血脂，其中UFA部分由自身合成，而高不饱和脂肪酸需要从饲料中获取。FATP1基因在哺乳动物的多种组织中表达，其主要作用是参与LCFA的摄取、转运和甘油三酯的合成[8-9]，FATP1基因的表达影响着水牛奶中乳脂率和FA组成。试验结果表明，H组、M组和L组不同乳脂率水牛乳中LCFA、UFA含量依次降低，其中LCFA含量H组极显著高于M组和L组，M组的显著高于L组；UFA含量H组极显著高于L组，显著高于M组，M组含量与L组含量无显著差异。乳脂率与总脂肪酸的含量、LCFA的含量和UFA的含量呈极显著正相关。本试验研究结果与潘斌[10]对湖北杂交水牛中高乳脂率会优化乳中脂肪酸的结果相一致。乳腺作为哺乳动物的一种重要器官，每个腺泡周围都分布着密集的毛细血管网，血液可以为腺泡提供充足的营养物质和氧气，为乳汁的合成提供必要条件。因此，乳腺FA摄取和转运相关基因的表达对乳中的脂质含量有一定的影响。利用心脏特异性过表达FATP1的转基因小鼠，其游离FA的摄取量提高4倍[11]，FATP1基因通过调控FA摄取、转运和代谢，从而间接影响乳腺FA的吸收和转运，对奶水牛乳脂改良具有非常重要的意义。研究结果表明，3种不同乳脂率的德宏奶水牛乳腺组织中FATP1基因mRNA表达水平H组极显著高于L组，与M组无显著差异，而M组与L组FATP1基因mRNA表达水平也无显著差异。FATP1基因的表达水平在泌乳期乳腺组织中H组的表达量最高，与乳腺组织合成高乳脂率水牛奶的需要相适应。FATP1可能在LCFA经历血液中摄取后，到达乳腺上皮细胞，然后在膜结合转运蛋白作为运载体，通过跨膜转运进入到胞质内，然后与胞质内FA结合蛋白结合，甘油三酯的合成、β-氧化等代谢过程，发挥FA跨膜转运的作用，将LCFA转运到乳腺上皮细胞内，实现外源性FA的摄取和转运，在乳腺FA转运过程中起着关键作用[12-13]。试验结果表明，乳脂率与LCFA和UFA的含量呈极显著正相关；FATP1基因的表达量与乳脂率、总脂肪酸含量、LCFA含量、UFA含量呈极显著正相关。由此可以推断，FATP1基因mRNA的表达可以促进LCFA和UFA的摄取和转运，从而促进乳脂的合成，但是FATP1基因是如何促进乳脂合成的信号通路需要进一步的研究。4结论德宏奶水牛乳中的乳脂率、总脂肪酸、LCFA、UFA含量和FATP1基因mRNA表达水平均为H组M组L组。乳脂率与乳中总脂肪酸、LCFA和UFA含量间呈极显著正相关；FATP1基因mRNA表达水平与乳脂率、LCFA含量、UFA含量、FA总量均呈极显著正相关，该基因对乳脂的合成有促进作用。