肉鸡在生产过程中面临着抗病力差、免疫功能低以及易受外界应激源刺激等问题[1]。化学药物免疫增强剂都不同程度的存在着降低机体生产性能、引发毒副作用和药物残留、危害人体健康等弊端[1]。中草药饲料添加剂安全性高，可增强动物免疫能力、增加动物体重、促进机体吸收营养物质等功能，已被广泛应用到各种畜禽养殖中[2-4]。中药应用于饲料添加剂中，常是将中药直接粉碎后以一定比例加入饲料中[5-6]。这种方法投用量较大，不易控制用量和效果。中药提取物加入饲料的研究较少[7-8]。试验研究制备一种提高肉鸡免疫力的中药复方添加剂，该复方由黄芪和甘草等中药组成。黄芪中多糖、皂苷以及甘草中三萜皂苷（甘草酸、甘草次酸）、多糖等均具有明显的提高免疫的效果[9-12]。其中，多糖和皂苷的含量较多，免疫效果较强[13-14]。黄芪多糖、总皂苷均有不同程度的清除自由基的作用[15-17]。因此，本试验选取总皂苷和多糖为评价指标，通过响应面试验优化提取工艺条件，并研究多糖对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、羟自由基的抗氧化性和总氧化能力，以期为此饲料添加剂的物质基础研究及工艺研究提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器试验药品：黄芪、甘草等药材购自北京同仁堂药店；D-葡萄糖标准品购自中国食品药品检定研究院，批号110833-201205；黄芪甲苷标准品购自中国食品药品检定研究院，批号110813-201206；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自上海梯希爱化成工业发展有限公司；三吡啶吖嗪（TPTZ）购自南京都莱生物技术有限公司；维生素C（VC）购自山西太原药业有限公司；无水乙醇、香草醛、95%乙醇、浓硫酸、苯酚购自天津市大茂化学试剂厂；邻菲罗啉、硫酸亚铁、30%过氧化氢、三氯化铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠购自天津科密欧化学试剂有限公司。试验仪器：TU-1810紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；SC-02低速离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；AX124ZH万分之一分析天平购自奥豪斯仪器有限公司。1.2试验方法1.2.1溶液的制备分别精密称取D-无水葡萄糖和黄芪甲苷对照品适量，用蒸馏水和无水乙醇溶解，配制成0.05 g/L葡萄糖对照品溶液和0.08 g/L黄芪甲苷对照品溶液。分别取黄芪、甘草等药材适量，粉碎后过4号筛，取过筛的粉末按一定比例混合，备用。准确称取上述粉末2 g，加入适量蒸馏水溶解，按照一定的提取时间和提取次数进行回流提取，再以3 000 r/min的速率离心3 min，得到的上清液即为样品溶液。1.2.2含量测定按照文献[18-19]进行多糖和总皂苷的显色和测定。1.2.3方法学考察1.2.3.1葡萄糖和黄芪甲苷标准曲线的制备精密吸取D-葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，分别置于25 mL容量瓶中加蒸馏水至刻度线，摇匀。分别精密移取1 mL上述溶液，按照1.2.2项下显色后测定吸光度。以吸光度A为纵坐标、葡萄糖浓度c为横坐标，绘制标准曲线。D-葡萄糖标准曲线为A=41.711c-0.024 5，R=0.998 8，线性范围为0.008~0.020 g/L。精密吸取黄芪甲苷对照品溶液0、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 mL，加无水乙醇至0.50 mL，按照1.2.2项下显色后测定吸光度值。黄芪甲苷浓度c与吸光度A符合如下方程：A=1.627 5c-0.024 5，R=0.998 3。黄芪甲苷在0.16~0.48 g/L浓度范围内满足此方程。1.2.3.2精密度试验将葡萄糖标准溶液稀释42倍，分别取1 mL上述溶液6份于具塞试管中，显色并测定。精密吸取0.15 mL黄芪甲苷对照品溶液6份，用无水乙醇补足至0.5 mL，显色并测定。吸光度的RSD分别为2.5%和2.3%，说明该方法精密度良好。1.2.3.3稳定性试验精密称取2 g混合粉末，选液料比10 mL/g，提取时间80 min，提取1次，按1.2.1项下方法制备样品溶液，将此溶液放置0、2、4、6、8和12 h，按要求显色并测定多糖和总皂苷吸光度。多糖和总皂苷吸光度的RSD值分别为3.8%和3.2%，说明多糖和总皂苷在12 h内比较稳定。1.2.3.4重复性试验精密称取6份同一批样品混合粉末2 g，加入20 mL蒸馏水，回流提取80 min，按1.2.1和1.2.2项下方法提取1次、显色和测定，计算多糖和总皂苷得率。多糖和总皂苷得率的RSD值分别为4.0%和4.4%，说明该方法重复性较好。1.2.4单因素试验1.2.4.1液料比的影响采用液料比6、8、10、12和14 mL/g，水浴回流60 min，提取1次的提取条件，计算多糖和总皂苷得率。1.2.4.2提取时间的影响选1.2.4.1项下最佳液料比，当提取1次，考察提取时间为40、60、80、100和120 min，对多糖和总皂苷得率的影响。1.2.4.3提取次数的影响选1.2.4.1和1.2.4.2项下最佳液料比和提取时间，考察提取1、2、3次对多糖和总皂苷得率的影响。1.2.5响应面法优化多糖和总皂苷提取工艺（见表1）选取上述单因素研究的3个因素，以多糖和总皂苷得率为响应值进行试验。试验因素及水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.T001表1Box-Behnken试验因素水平水平A液料比/(mL/g)B提取时间/minC提取次数/次-110801012100211412031.2.6体外抗氧化试验分别配制浓度为0.625、1.250、2.500、5.000和10.000 g/L的复方黄芪冻干粉水溶液和VC溶液。1.2.6.1DPPH自由基清除能力的测定参照文献[20]测定。取不同浓度的复方黄芪水提液及VC溶液各0.5 mL，分别加入0.084 mg/L DPPH的乙醇溶液2.5 mL，室温下避光反应30 min，以同体积溶剂代替样品作参照，反应结束后于波长517 nm处测定各溶液的吸光度值（As）。同样条件下，以无水乙醇为空白对照测定DPPH溶液吸光度值（Ac）。DPPH自由基清除率(CR)=(1-As/Ac)×100%(1)式中：CR为复方黄芪DPPH自由基清除率（%）；As为不同浓度复方黄芪提取液的吸光度值；Ac为阳性对照VC的吸光度值。1.2.6.2OH自由基清除能力的测定分别取0.75 mmol/L的邻二氮菲无水乙醇溶液1 mL于7支试管中，均加入0.15 mol/L的PBS缓冲液2 mL，同时加入不同浓度的复方黄芪水提液及VC溶液各1 mL，振荡至完全混匀，进行羟自由基清除能力的测定。羟自由基的清除率(CR)=(Bs-Bc)/(Bb-Bc)×100%(2)式中：CR为复方黄芪DPPH自由基清除率（%）；Bs为不同浓度复方黄芪提取液的吸光度值；Bb为同体积蒸馏水代替样品后的吸光度值；Bc为同体积蒸馏水代替样品及H2O2溶液后的吸光度值。1.2.6.3FRAP总抗氧化能力的测定参照文献[21]测定。在试管中分别加入200 μL适宜浓度复方黄芪溶液，精密加入6 mLFRAP溶液（0.3 mol/L醋酸盐缓冲液∶10 mmol/L TPTZ溶液∶20 mmol/L FeCl3=10∶1∶1），进行FRAP总抗氧化能力的测定和计算。1.3数据统计与分析单因素试验及抗氧化活性数据采用Origin 9.0软件分析；采用Design-Expert.V10.0软件分析响应面试验数据。2结果与分析2.1复方黄芪中多糖和总皂苷提取单因素试验2.1.1液料比对多糖和总皂苷得率的影响（见图1）由图1可知，液料比为6 mL/g时，多糖得率为最高，但是由于水量太少，溶液比较黏稠，不易后续操作，因而不选择此条件。当液料比在8~14 mL/g之间变化时，液料比为12 mL/g时，多糖得率为最高。对于总皂苷来说，总皂苷得率随着液料比增加而增加；但当液料比从12 mL/g增加到14 mL/g时，总皂苷得率增加缓慢。综合考虑，选择12 mL/g为最佳液料比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F001图1液料比对多糖和总皂苷得率的影响2.1.2提取时间对多糖和总皂苷得率的影响（见图2）由图2可知，100 min时多糖得率达到最大。100 min后得率下降，可能由于黄芪多糖长时间在高温下发生分解[22]。总皂苷也在100 min时得率最高值，因此选择100 min为最佳提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F002图2提取时间对多糖和总皂苷得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.T002表2Box-Behnken试验设计方案与多糖和总皂苷得率结果序号A液料比/（mL/g）B提取时间/minC提取次数/次多糖得率/%总皂苷得率/%11080213.116.6821480223.356.90310120211.786.84414120227.686.9651010019.936.82614100121.337.03710100313.466.61814100331.676.5191280117.336.971012120110.567.01111280314.676.611212120325.896.651312100228.627.121412100227.317.161512100228.367.151612100232.467.171712100228.217.192.1.3提取次数对多糖和总皂苷得率的影响（见图3）由图3可知，多糖和总皂苷得率均随着提取次数的增加而增大，为降低成本、缩短生产周期[23]，选择2次为最佳提取次数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F003图3提取次数对多糖和总皂苷得率的影响2.2响应面曲线法优化复方黄芪中多糖和总皂苷提取工艺2.2.1响应面试验设计与结果（见表2）采用DesignExpert V10.0软件对各因素及响应值进行多元线性回归。2.2.2二次多项回归方程建立与显著性检验（见表3）利用Design-Expert v8.0.5对试验数据进行二次多元回归拟合，建立多元二次响应面的回归模型[24]。多糖和总皂苷的回归方程分别为：Y=0.29+0.07A+0.007 5B+0.033C+0.015AB+0.015AC+0.045BC-0.041A2-0.06B2-0.061(3)Y=7.16+0.056A+0.037B-0.18C-0.025AB-0.078AC+0BC-0.196A2-0.12B2-0.23C2 (4)多糖和总皂苷的相关系数R分别为0.991 0和0.992 8，P均小于0.000 1，失拟项P=0.849 2和0.089 7均大于0.05，说明此回归方程的建立和实际情况相吻合，试验误差较小，该回归方程可以用来预测黄芪复方多糖和总皂苷提取的最佳工艺条件。多糖回归模型显著性结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.T003表3多糖回归模型显著性结果方差来源平方和自由度均方和P值模型0.100 090.011 00.000 1**A液料比0.039 010.039 00.000 1**B提取时间0.000 510.000 50.229 8C提取次数0.008 510.008 50.000 7**AB0.000 910.000 90.105 1AC0.000 910.000 90.105 1BC0.008 110.008 10.000 8**A20.007 010.006 90.001 3**B20.015 010.015 00.000 1**C20.015 010.015 00.000 1**误差0.001 870.000 3失拟项0.000 330.000 10.849 2净误差0.001 540.000 4总和0.100 016注：数据肩标**表示影响极显著（P0.01）。由表3可知，对多糖得率影响极具显著性的是A、C、BC、A2、B2和C2。同理进行了总皂苷的回归模型显著性分析，结果表明，对总皂苷得率影响极具显著性的因素是：A、C、AC、A2、B2和C2，而B也有显著性影响。通过比较回归方程中变量系数值大小可以得出，对多糖和总皂苷得率的影响顺序为ACB。2.2.3响应面分析与工艺预测（见图4）根据试验结果，采用Design-Expert V10.0软件作响应面及等高线图。响应面坡度的平缓陡峭程度反映因素间交互效应的显著性，曲面坡度陡峭，显著性越大；反之，显著性越小[25]。等高线的形状反映因素间交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用强，圆形则相反[26]。多糖的响应面结果见图4。图4各因素交互作用对的响应面分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F00410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F00510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F006由图4可知，提取时间与提取次数（BC）交互作用对多糖得率的影响有显著性。同理我们分析了总皂苷的响应面，结果显示液料比与提取次数两因素间交互作用对总皂苷得率影响显著。2.2.4合适条件和验证试验通过软件分析，得到多糖和总皂苷最佳提取工艺为液料比12.13 mL/g、11.887 mL/g，提取101.21 min、101.29 min，提取2.29、2.421次。结合实际，调整提取条件为：液料比12 mL/g，提取2次，提取100 min。在上述条件下重复试验3次，测得黄芪复方多糖和总皂苷平均得率分别为32.10%和7.08%。验证结果与模型预测的结果接近，说明此响应面法可靠，此工艺稳定可行。2.3体外抗氧化试验自由基过量易损伤细胞，对身体有潜在危害，因此研究抗氧化活性减少自由基的产生或加速清除研究。采用VC作对照，综合考察黄芪复方饲料添加剂的体外抗氧化活性。2.3.1DPPH自由基清除能力的测定（见图5）由图5可知，黄芪复方在浓度0.625～2.500 g/L之间抗氧化能力随着浓度的增大而增强，在2.5 g/L处达到峰值；VC对DPPH自由基清除能力随着浓度增大而增强，在1.25 g/L处达到峰值，随后二者的清除能力均随浓度的增大而减小。可以看出，浓度小于1.25 g/L时，VC的抗氧化作用明显强于黄芪复方；当浓度大1.25 g/L时，黄芪复方的抗氧化作用强于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F007图5两种物质对DPPH自由基清除率柱状图2.3.2羟自由基清除能力的测定（见图6）由图6可知，当黄芪复方浓度从0.625 g/L变化到5 g/L时，其对羟自由基清除能力呈现减小趋势，并且其清除能力均高于同浓度的VC。而当其浓度为10 g/L时，VC对羟自由基的清除能力强于黄芪复方。但从清除羟自由基整体水平来看，黄芪复方的抗氧化能力强于VC的。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F008图6两种物质对羟自由基的清除率柱状图2.3.3FRAP 总抗氧化能力的测定（见图7）经研究，FRAP工作曲线为Y=0.376 3x-0.030 3，R=0.999 90.99，线性范围为0.4~1.2 mmol/L。由图7可知，黄芪复方FRAP总抗氧化能力有一定浓度依赖性。随着黄芪复方浓度增加，FRAP当量增加，总抗氧化能力增强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.013.F009图7黄芪复方 FRAP 总抗氧化能力柱状图3讨论近年来，文献中提取多糖和皂苷选用超声法较多[22]，但工业上无法利用超声提取大规模生产，因而试验采用回流提取法。该饲料添加剂主要提取多糖和总皂苷成分，多糖的提取适合用水提取，总皂苷适合用有机溶剂提取，此配方为肉鸡饲料添加剂，考虑到成本、安全性等因素，选取水回流进行提取工艺研究。4结论试验采用回流法提取黄芪复方多糖和总皂苷，此法操作简单、重复性好、稳定性好。为黄芪复方饲料添加剂的质量控制及物质基础研究提供参考。黄芪复方在一定浓度范围内，对DPPH自由基和OH自由基均有一定的清除能力，且黄芪复方具有一定的总抗氧化能力。从2020年7月1日起我国明令禁止饲料生产企业生产含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料，而保留中药类饲料添加剂规定的实行，提高免疫类中药饲料添加剂由于其绿色安全必将在食品领域的应用越来越广泛。