滩羊是我国特有的优良轻裘皮绵羊品种，“二毛皮”更是久负盛名，享誉海内外[1]。近年来，关于滩羊被毛卷曲的研究主要集中于弯曲密切相关的候选基因及信号通路的研究，通过滩羊mRNA和miRNA的综合分析，提供了控制弯曲形成的潜在机制[2]。本研究基于前期利用基因组学和转录组学筛选出的与滩羊皮毛发育相关的候选基因Hoxc13基因，采用PCR和DNA测序方法，进行滩羊二毛皮Hoxc13基因与二毛性状的关联研究，为解析相关基因调控滩羊毛皮发育的分子机制提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验选择100只滩羊颈静脉采血，置于EDTA抗凝管，-20 ℃保存。滩羊来自宁夏盐池朔牧滩羊有限公司。1.2二毛性状测定方法采用GB/T 2033—2008方法测定35日龄左右的滩羊羔羊毛长、毛股弯曲数。1.3滩羊全血DNA提取及浓度的检测采用血液基因组DNA提取试剂盒（DP318-03，天根生化科技公司）进行DNA提取，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度。1.4引物信息（见表1）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.002.T001表1Hoxc13基因引物Tab.1Hoxc13 gene primer基因名称引物序列(5'→3')产物长度/bp退火温度/℃Hoxc13F：AGCAGCCAACCTCCTCTAAGT32962.5R：TTCAGTGACCAGATTAACAGGC根据Genebank提供的绵羊Hoxc13 基因序列，利用Primer5.0在线设计引物，引物由上海生工进行合成。1.5PCR扩增体系与反应程序PCR扩增体系：20~50 μg/L模板DNA 1~2 μL、10 μmol/L引物F 2 μL、10 μmol/L引物R 2 μL、10 mmol/L Dntp (mix) 2 μL、10×Taq Buffer (with MgCl2) 5 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL，添加ddH2O至50 μL。PCR扩增反应：95 ℃预变性3~5 min；94 ℃变性30 s，55~60 ℃退火25~30 s， 72 ℃延伸30~50 s，35个循环； 72 ℃修复延伸5~8 min。1.6PCR产物检测利用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测，电泳参数：150 V、100 mA、10~20 min电泳观察。1.7PCR产物测序分型利用PCR产物纯化回收试剂盒（批号：B518141，生工生物工程（上海）股份有限公司）对PCR条带进行回收纯化，并送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，根据序列比对，进行Hoxc13基因基因型分型。1.8数据统计与分析1.8.1基因频率与基因型频率统计C等位基因频率=（2×CC基因型个体数量+CT型个体数量）/（2×群体数量）（1）T等位基因频率=（2×TT基因型个体数量+CT型个体数量）/（2×群体数量）（2）CC基因型频率=CC基因型个体数量/群体数量（3）CT基因型频率=CT基因型个体数量/群体数量（4）TT基因型频率=TT基因型个体数量/群体数量（5）1.8.2基因型与性状关联分析采用SAS 8.02统计软件的GLM程序对基因型与二毛性状进行关联分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1滩羊全基因组DNA电泳检测结果（见图1）由图1可知，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳对滩羊基因组DNA进行检测，结果表明，提取的基因组DNA无降解，DNA纯度可达到后续试验要求。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.002.F001图1滩羊全基因组DNA电泳检测结果Fig.1DNA electrophoresis detection results of whole genome of Tan Sheep注 ： M为Marker SM0331；1~10号为1~10号样品。2.2Hoxc13基因多态性检测结果（见图2）由图2可知，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测Hoxc13基因扩增产物，结果与图1条带一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.002.F002图2Hoxc13基因多态性检测结果Fig.2Hoxc13 gene polymorphism detection results注 ： M为MarkⅡ；1~7为滩羊Hoxc13基因PCR产物。2.3Hoxc13基因PCR产物测序结果（见图3~图5）由图3~图5可知，通过Hoxc13基因PCR扩增产物测序分析，发现Hoxc13基因在滩羊群体中存在3种基因型：CC型、CT型和TT型。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.002.F003图3Hoxc13基因CC型PCR产物测序结果Fig.3Sequencing results of Hoxc13 gene CC type PCR productsXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.002.F004图4Hoxc13基因CT型PCR产物测序结果Fig.4Sequencing results of Hoxc13 gene CT type PCR productsXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.002.F005图5Hoxc13基因TT型PCR产物测序结果Fig.5Sequencing results of Hoxc13 gene TT type PCR products2.4Hoxc13基因的等位基因和基因型频率（见表2）由表2可知，滩羊群体中TT基因型频率17%，CT基因型频率为38%，CC基因型为45%；等位基因频率为C（64%）、T（36%）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.002.T002表2滩羊Hoxc13基因等位基因和基因型频率Tab.2Allele and genotype frequency of Hoxc13 gene in Tan sheep项目样本数等位基因频率/%基因型频率/%CTTTCTCC滩羊10064361738452.5Hoxc13基因多态性与二毛性状关联（见表3）由表3可知，Hoxc13基因不同基因型的弯曲数差异不显著（P0.05）。CT基因型滩羊毛长比CC基因型多1.06 cm（P0.01），比TT基因型多1.84 cm（P0.01）；CC基因型滩羊平均毛长比TT基因型多0.24 cm（P0.05）。结果表明，C等位基因与滩羊二毛期毛长呈显著正相关（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.01.002.T003表3Hoxc13基因多态性与二毛性状关联Tab.3Association of Hoxc13 gene polymorphism with hirsute traits基因型样本数毛长/cm弯曲数/个肩部股部CT3811.16±0.98A4.35±1.114.14±0.68CC459.56±0.92B4.12±1.113.98±1.11TT179.32±0.89B3.97±1.113.85±1.11注 ：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P0.01)。3讨论作为同源异型盒基因（Homeobox，Hox）基因家族Abd-B类成员，Hoxc13基因在动物毛囊发育、毛发的生长过程中的表达直接影响毛发的特性。尤其是在哺乳动物毛囊的周期性发育过程中，Hoxc13基因通过控制毛发结构蛋白角蛋白（KP）和角蛋白关联蛋白（KAP）在毛囊不同时期的不同表达，进行毛囊生长期、退行期和休止期之间转换，进而直接控制毛发性状的形成和改变[3-4]。研究发现，Hoxc13基因在苏博美利奴羊皮肤组织的表达量高于其他器官组织，表明Hoxc13基因参与皮肤毛囊发育过程[5]。在陕北白绒山羊羊绒周期生长过程中，转录因子Hoxc13通过对KRT38、KRT84基因正调控和对KRT1基因负调控直接影响毛囊发育[6]。马朝[7]通过扩增绒山羊和蒙古羊Hoxc13基因片段，并进行序列比对，结果发现，哺乳动物Hoxc13基因非常保守，同源性非常高，出生两周后的绒山羊羔羊皮肤中Hoxc13基因的表达量比70 d胚胎的皮肤中多。张燕军等[8]研究构建绒山羊Hoxc13基因过表达载体，分离并克隆了内蒙古绒山羊Hoxc13基因的cDNA序列，并构建该基因的过表达载体pECFP-Hoxc13。Hoxc13基因具有比较保守的遗传特性，虽然在陕北白绒山羊和内蒙古绒山羊中未发现Hoxc13基因与KAP16.2和KAP16.6基因的相关突变[9]，但获得了西藏绒山羊Hoxc13基因的CDS序列，并揭示了西藏绒山羊Hoxc13基因的多态性和表达研究[10]。研究发现，Hoxc13基因SNPs位点与西藏绒山羊纤维直径性状有关，并可作为高效选育超细型西藏绒山羊纤维直径性状相关的分子标记[11]。Hoxc13基因在陕北白绒山羊高产和低产绒量皮肤组织在生长期平均相对表达量低于休止期。Hoxc13基因可通过对KAP9.2基因的表达调控抑制绒毛生长[12]。在毛发生长发育过程中，Wnt信号通路可调控 Hoxc13基因的表达，Hoxc13基因可以增强毛发角蛋白的启动子活性，抑制非毛发角蛋白的启动子活性。因此Hoxc13基因通过对毛发角蛋白和非毛发角蛋白的不同调控功能参与毛囊分化的分子机制[13]。滩羊二毛皮是滩羊出生后35 d左右表现的毛发性状，有研究表明，其性状形成可能与胚胎期控制毛囊与毛纤维发育相关基因的表达及其调控有关[14]。滩羊二毛期毛长的平均值为8.08 cm，二毛期弯曲数平均值为6个，二毛期毛长与侧部弯曲呈极显著中等正相关[1]。在应用iTRAQ技术分析滩羊初生期与二毛期的差异蛋白的研究中，结果显示，滩羊二毛期皮肤有高表达差异蛋白122个，不同蛋白的表达对二毛期毛囊发育和毛发弯曲形成有关[15]。综上所述，Hoxc13基因可能为控制滩羊毛纤维发育相关基因，通过调控二毛期皮肤蛋白的表达从而影响毛囊发育和毛发弯曲的形成。4结论本研究结果显示，Hoxc13基因在滩羊群体中存在3种基因型，即CC型、CT型和TT型；群体中CC基因型频率17%，CT基因型频率为38%，TT基因型为45%，等位基因频率为C（64%）、G（36%）；基因型CT个体毛长显著高于基因型CC、TT（P0.05）。结果表明，Hoxc13基因可以作为滩羊二毛性状分子标记辅助选育的关键基因，在育种工作中可以选择Hoxc13基因CT基因型个体进行滩羊串子花品系选育。