乳酸菌（LAB）具有无毒、无害、低耐药性的优点，在动物生产中应用较多，但由于乳酸菌长期保存比较困难、使用及运输不便，因此如何保存和储藏乳酸菌备受关注。冷冻干燥技术是在低温、低压、真空条件下使样品中水分凝结成冰，使冰升华，获得干燥状态的菌粉，是乳酸菌较为理想的保藏方式[1-2]。但利用冷冻干燥技术生产菌粉也会对菌体细胞造成一定程度损伤，因此为了保持菌株活力，需要选择能够在冷冻干燥过程中起保护作用且具有良好自身稳定性的保护剂。葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂乳、谷氨酸钠、麦芽糊精、甘油等是比较常用的冷冻保护剂。糖类物质所含羟基能够与乳酸菌细胞膜磷脂基团形成氢键，阻止细胞膜因失水而成凝胶态，保持细胞膜流动性，防止蛋白变性，使菌体细胞在低温和失水条件下仍能够维持细胞膜与蛋白质功能。脱脂乳中乳清蛋白能够在冻干过程中形成蛋白膜包裹于细胞外部，进而保护细胞免受损伤。本试验通过添加不同保护剂对3株乳酸菌进行冷冻干燥，比较不同保护剂及不同保藏温度下菌制剂存活率变化，为不同乳酸菌制剂的生产及保藏提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株戊糖片球菌H2（M2020840）、海氏肠球菌H15（M2020841）、戊糖乳杆菌H18（M2020842），筛自青海黑藏羊和西藏绒山羊瘤胃内容物，保藏于青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室。1.1.2乳酸菌冻干保护剂保护剂1：脱脂乳12%、海藻糖1%、谷氨酸钠1%、甘油3%，参考张英华等[3]的方法配制。保护剂2：脱脂乳10%、甘油10%，参考王利红[4]的方法配制。保护剂3：脱脂乳9.51%、葡萄糖7.56%、麦芽糊精7.77%，参考李玲等[5]的方法配制。1.1.3MRS培养基MRS液体培养基（1 000 mL）：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸二铵2 g、吐温80 1 mL、K2HPO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、牛肉膏10 g、超纯水1 000 mL。1.1.4主要仪器设备LGJ-12冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）、LS-100HD高压灭菌锅（江阴滨江医疗设备有限公司）、DW-86L38-80 ℃超低温冰箱（青岛海尔电器有限公司）、CJ-2S超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司）、TG2-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.2测定指标及方法1.2.1乳酸菌冻干粉制备戊糖片球菌、海氏肠球菌、戊糖乳杆菌经活化后按照3%接种于MRS培养至稳定生长期；8 000 r/min离心10 min，弃上清液，收集菌泥，使用无菌PBS缓冲液清洗菌泥2~3次；菌泥称重后按照1∶1加入保护剂溶液，充分搅拌均匀，分装至冻干瓶中（1 mL/瓶）。各保护剂组每种菌各取3瓶，测定冻干前活菌数，其余冻干瓶4 ℃冰箱预冷2 h，置于-80 ℃预冻12 h，将预冻完成的冻干瓶放入提前预冷好的真空冷冻干燥机，-56 ℃，5 Pa以下冷冻干燥24 h；冻干后各保护剂组每种菌各取3瓶复水，稀释，测定冻干后活菌数。1.2.2活菌计数方法采用平板菌落计数法测定活菌数，取100 μL菌悬液进行10倍梯度稀释，分别吸取适量不同的稀释梯度菌悬液于MRS琼脂平板上，均匀涂开，将平板倒置于37 ℃恒温培养箱培养24~48 h，待平板上长出单菌落，选择菌落数在30~300的平板计菌落数，计算冻干存活率。冻干存活率=冻干后活菌数/冻干前活菌数×100%(1)1.2.3乳酸菌冻干粉保存将不同保护剂组乳酸菌冻干后计活菌数，将各保护剂组乳酸菌冻干粉平均分为3份，分别于-80、-20、25 ℃（常温）条件下保藏，分别在保藏期7、14、30、60 d取样，冻干菌粉复水稀释涂板，进行菌落计数，计算不同保藏时间菌粉活菌数。将不同保藏时间菌粉活菌数与初始冻干粉活菌数比较，计算不同保藏时间保藏存活率，比较不同保护剂组不同乳酸菌冻干粉在不同保藏温度条件下存活率的变化规律。保藏存活率=不同保藏时间菌粉活菌数/初始冻干粉活菌数×100%(2)1.3数据统计与分析采用SPSS 20.0统计软件中ANOVA程序进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同乳酸菌冻干粉感官指标（见图1）由图1可知，3种乳酸菌菌泥分别与不同保护剂混合均匀后经预冷、预冻、冷冻干燥后，冻干粉感官品质良好，色泽呈乳白色或淡黄色，具有酸香味，结构较为疏松有气孔，达到预期要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.019.F001图1不同乳酸菌冻干粉感官指标2.2不同保护剂对乳酸菌冻干存活率的影响（见表1）由表1可知，保护剂3对戊糖片球菌和戊糖乳杆菌的保护效果最好，其存活率分别为81.80%、79.90%，活菌数分别为5.13×1012 CFU/g、2.21×1012 CFU/g。保护剂1对海氏肠球菌的保护效果最好，其存活率为84.83%，活菌数为7.3×1011 CFU/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.019.T001表1不同保护剂对乳酸菌冻干存活率的影响项目戊糖片球菌海氏肠球菌戊糖乳杆菌保护剂174.60±6.80b84.83±4.48a78.67±12.74保护剂251.23±8.38c65.93±8.62b49.63±13.05保护剂381.80±4.00a69.40±2.60b79.90±15.62注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%2.3不同保护剂和保藏温度对戊糖片球菌冻干存活率的影响（见表2）由表2可知，戊糖片球菌保藏60 d，在-80 ℃条件下，保护剂1冻干粉存活率下降至58.00%，保护剂2冻干粉存活率下降至21.63%，保护剂3冻干粉存活率下降至14.27%；在-20 ℃条件下，保护剂1冻干粉存活率为28.87%，保护剂2冻干粉存活率为19.90%，保护剂3冻干粉存活率为13.33%；在常温保藏条件下，保护剂1冻干粉存活率为22.07%，保护剂2冻干粉存活率仅为13.64%，保护剂3冻干粉存活率为10.43%。研究表明，随着保藏温度升高，戊糖片球菌的死亡速度加快，本试验中-80 ℃保藏条件下保护剂1对冻干粉稳定效果更好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.019.T002表2不同保护剂和保藏温度对戊糖片球菌冻干存活率的影响时间温度/℃保护剂1保护剂2保护剂3第0 d25（常温）100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00-20100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00-80100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00第7 d25（常温）91.57±6.5252.07±7.5619.90±3.57-2094.43±3.9362.17±2.6923.77±8.01-8096.17±2.7066.30±13.6023.03±0.99第14 d25（常温）42.33±5.2138.63±2.5815.07±3.18-2055.20±6.9054.37±5.8114.87±1.55-8073.87±9.6152.60±6.1921.77±3.29第30 d25（常温）38.70±8.4617.33±2.6712.37±2.76-2043.17±8.3126.20±4.2214.67±2.38-8055.00±2.9534.17±3.6321.80±1.73第60 d25（常温）22.07±7.4813.64±3.9710.43±3.56-2028.87±5.1819.90±5.9213.33±3.12-8058.00±12.1421.63±0.7414.27±2.20%2.4不同保护剂和保藏温度对海氏肠球菌冻干存活率的影响（见表3）由表3可知，海氏肠球菌保藏60 d，在-80 ℃条件下保护剂1冻干粉存活率下降至44.53%，保护剂2冻干粉存活率下降至38.57%，保护剂3冻干粉存活率下降至36.20%；在-20 ℃条件下，海氏肠球菌保护剂1冻干粉存活率为39.57%，保护剂2冻干粉存活率为35.50%，保护剂3冻干粉存活率为26.07%；在常温条件下，海氏肠球菌保护剂1冻干粉存活率为32.03%，保护剂2冻干粉存活率为12.47%，保护剂3冻干粉存活率仅为17.43%。研究表明，随着保藏温度升高，海氏肠球菌存活率下降更快，在本试验中-80 ℃保藏条件下不同保护剂也会影响海氏肠球菌存活率，其中保护剂1效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.019.T003表3不同保护剂和保藏温度对海氏肠球菌冻干存活率的影响时间温度/℃保护剂1保护剂2保护剂3第0 d25（常温）100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00-20100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00-80100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00第7 d25（常温）85.83±6.3957.37±8.8127.10±4.36-2090.35±2.8578.10±13.2048.43±6.88-8088.80±7.1575.03±18.7347.63±1.56第14 d25（常温）77.27±6.9943.47±4.6522.80±1.80-2076.00±5.1953.00±5.3837.20±1.95-8080.40±8.6062.00±15.8847.37±3.30第30 d25（常温）59.60±18.3926.53±1.1625.77±2.06-2070.07±5.2546.83±8.3031.47±2.11-8077.40±2.7047.57±3.9342.53±2.55第60 d25（常温）32.03±11.1312.47±2.9517.43±1.27-2039.57±1.9335.50±2.9726.07±2.55-8044.53±2.9438.57±1.7636.20±3.05%2.5不同保护剂和保藏温度对戊糖乳杆菌冻干存活率的影响（见表4）由表4可知，戊糖乳杆菌保藏60 d，在-80 ℃条件下保护剂1冻干粉存活率下降至44.80%，保护剂2冻干粉存活率下降至23.13%，保护剂3冻干粉存活率下降至24.10%；在-20 ℃条件下，保护剂1冻干粉存活率为37.27%，保护剂2冻干粉存活率为17.17%，保护剂3冻干粉存活率为20.03%；在常温条件下，保护剂1冻干粉存活率为31.27%，保护剂2冻干粉存活率为16.00%，保护剂3冻干粉存活率为18.20%。研究表明，随着保藏温度升高，会加快戊糖乳杆菌死亡速度，且各保藏温度下，保护剂1冻干粉存活率均高于另外两种保护剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.019.T004表4不同保护剂和保藏温度对戊糖乳杆菌冻干存活率的影响天数温度/℃保护剂1保护剂2保护剂3第0 d25（常温）100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00-20100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00-80100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00第7 d25（常温）87.13±4.8659.63±11.3040.27±7.10-2088.47±7.7166.90±10.9246.23±6.63-8095.23±3.3679.17±14.7847.87±7.47第14 d25（常温）63.67±3.4536.33±2.8422.63±2.44-2076.73±6.0455.73±3.7335.70±3.10-8080.67±4.3972.57±1.5545.73±8.71第30 d25（常温）64.80±1.1023.07±2.9520.00±6.26-2059.30±11.8331.77±3.2025.13±1.75-8067.27±5.9243.00±8.5637.37±1.84第60 d25（常温）31.27±6.3016.00±1.1418.20±0.56-2037.27±8.8017.17±2.3720.03±1.97-8044.80±1.5723.13±3.4024.10±1.61%3讨论不同菌株、菌体细胞形态、保护剂系统、培养时间、冷冻干燥条件等均会影响冻干效果，因此可针对不同菌株筛选适宜的冻干保护剂降低冷冻干燥对菌体的损伤，提高菌体存活率[6-7]。陈胜杰等[8]研究表明，脱脂乳具有在菌体表面形成保护层、包裹菌体以减少胞内冰晶形成的作用，脱脂乳无论是单一使用还是作为复合保护剂组分均具有较好的冻干效果。蒲丽丽等[9]研究表明，糖类保护剂能够降低菌体冻干后死亡率，其中海藻糖保护效果最好，而且随着保护剂添加量增加，乳酸菌存活率上升，原因可能是糖类物质能调节乳酸菌细胞内的渗透压，对细胞膜和蛋白质等成分具有保护效果[10-11]，还可能是糖类物质具有大量羟基通过与蛋白质形成氢键稳定蛋白质结构以及与溶液中水分子结合，增加黏性减缓结晶过程，从而增强乳酸菌抗冷冻干燥的能力。甘油作为渗透型保护剂，通过渗透入细胞内与大分子物质形成氢键，降低细胞脱水皱缩的速率与程度；谷氨酸钠属于抗氧化类保护剂也能渗透到细胞内，具有修复受损细胞的能力[12]。研究表明，在对同一菌株的单因素试验中，谷氨酸钠比VC效果更好[13-14]，谷氨酸钠能够增加乳酸菌冻干粉保藏期间存活率。杜磊等[15]通过正交试验筛选得到复合保护剂的最佳配比为脱脂乳10%、谷氨酸钠5%、蔗糖10%，发现对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的冻干存活率达95%以上。杨辉等[16]研究表明，复合保护剂对乳酸菌的冻干效果明显高于单一保护剂。本试验表明，不同菌株最适保护剂不同，保护剂3对戊糖片球菌和戊糖乳杆菌冻干效果最好，冻干后存活率最高，分别为81.80%和79.90%，而保护剂1对海氏肠球菌冻干效果最高，存活率为84.83%。张英华等[3]研究发现，保护剂3组合使嗜热链球菌冻干后存活率达96.50%。李玲等[5]研究发现，保护剂1组合使乳酸球菌的冻干存活率为90.08%，冻干存活率均略高于本试验结果，出现此情况的原因可能是菌株不同所致。朱东升[17]研究表明，同一优良复合保护剂对3种乳酸菌的冻干存活率不同，与本试验结果一致。菌种的冻干存活率还可能受乳酸菌培养时间、离心过程、冷冻干燥条件的影响。李宝磊[18]研究表明，预冻温度与时间也影响菌体对冷冻干燥的抗性。岳林芳等[19]研究表明，内在基因是影响菌株冻干效果的首要因素，且冻干效果还与细胞膜的脂肪酸组成及菌体形态有关。本试验中，保护剂2对3种乳酸菌的冷冻干燥效果均较差，冻干存活率最高仅为65.93%，可能与复合保护剂组分单一、缺少糖类保护剂有关。本试验发现，随着保藏温度升高乳酸菌冻干粉存活率下降更快，表明在高温保藏条件下可能会加速菌体衰亡。李宝坤[20]研究表明，低温有利于菌粉保存，与本研究结果一致。原因可能是保藏温度高、时间延长菌体中关键酶失活从而导致菌体衰亡。本试验表明，不同保护剂对乳酸菌冻干粉的保藏效果也不同，在冻干过程中具有优良保护效果的保护剂在保藏过程中可能效果较差，原因可能是保护剂中某些物质的作用。本试验中，保护剂1的保藏效果最好，其中含有蛋白类、糖类、抗氧化类及渗透型保护剂甘油，比其他两种保护剂其组成更全面，所以表现效果较好。刘飞等[21]研究表明，添加复合保护剂普鲁兰多糖乳酸菌冻干菌粉保藏存活率下降缓慢。4结论本试验发现，保护剂3对戊糖片球菌和戊糖乳杆菌保藏效果最好，冻干后存活率分别为81.80%和79.90%；保护剂1对海氏肠球菌保藏效果最好，冻干后存活率为84.83%；-80 ℃保藏温度、保护剂1对3种乳酸菌制剂的长期保藏效果最好。