氨基酸（AA）是乳蛋白合成的重要前体物质之一，在乳腺发育和乳汁合成中起到重要作用[1]。Met是奶牛乳腺合成乳蛋白的第一限制性氨基酸，可以显著上调奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）内与乳蛋白合成相关的CSN1S1、CSN3、JACK2等基因的表达，进而提高乳蛋白合成量[2-3]。奶牛主要凭借分解自身组织蛋白、吸收消化道中的蛋白或依靠静脉回流在血液中积累的游离氨基酸，之后由乳腺利用这些游离氨基酸合成乳蛋白。本课题组前期研究发现，作为乳脂前体物（MFP）的乙酸可以调控奶牛乳腺对AA的摄取，促进乳蛋白合成相关基因CSN1S1、CSN3、JACK2和STAT5 mRNA的表达，进而调控乳蛋白合成[4-6]，表明奶牛乳腺内乳蛋白的合成对乳成分前体物（MCP）的利用可能存在协同作用，MFP与乳蛋白前体物（MPP）间在合成乳蛋白过程中可能存在互作效应，但目前鲜有相关的研究报道。本课题组前期研究表明，乙酸作为MFP，不仅对乳脂肪的合成具有调节作用，对乳蛋白的合成也具有调节作用[6-7]。因此，本研究以Met和乙酸作为MPP和MFP，以BMECs为模型，研究乙酸与Met相互作用对乳蛋白合成相关基因及蛋白表达的影响，为探讨MFP与MPP在乳成分合成过程中存在的相互作用及其机制提供参考。1材料与方法1.1试验设计采用胶原酶消化法培养BMECs，采用Sheng等[5]方法进行细胞培养。采用2×6双因素完全随机试验设计，因素一为乙酸的浓度，设6个水平，分别为0、4、6、8、10和12 mmol/L；因素二为Met浓度，设2个水平，分别为0.13 mmol/L和0.52 mmol/L。将第三代BMECs随机分为12个处理组，每组6个重复。BMECs贴壁率大约为80%~90%时，换为饥饿培养基，12 h后按照试验要求换为不同浓度乙酸和Met的培养基，37 ℃、5%CO2培养48 h，测定各项指标。1.2测定指标与方法1.2.1BMECs内乳蛋白合成相关基因表达的测定参考文献[7]采用Trizol法提取总RNA，使用酶标仪（Synergy H1）测定DNA浓度及OD值，凝胶电泳检测条带的完整性。RNA反转录使用PrimeScript RT reagent Kit（Takala）试剂盒并按说明书进行操作。依据SYBY Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takala）试剂盒说明书，以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参基因，采用实时荧光定量PCR仪（ABI-7500，ABI公司）测定BMECs内乳蛋白合成相关基因，包括乳蛋白合成相关基因：α-酪蛋白（CSN1S1）、β-酪蛋白（CSN2）、κ-酪蛋白（CSN3）、信号转导和转录激活因子5（STAT5）、真核起始因子4E（eIF4E）、p70核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）、Janus激酶2（JAK2）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、真核起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）和单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPKα1）的基因表达量，采用2－△△Ct法计算。引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.018.T001表1引物序列基因GenBank登录号引物序列（5'→3'）长度/bpα-酪蛋白（CSN1S1）NM_181029F：ACATCCTATCAAGCACCAAGGACTCR：GACGAAATGCTTTCAGCTTCCA192β-酪蛋白（CSN2）M-64755.1F：TCTGCCTCTGCTCCAGTCTTR：AGGAGGGGGCATTCACTTT116κ-酪蛋白（CSN3）NM_174294F：CCAGGAGCAAAACCAAGAACR：TGCAACTGGTTTCTGTTGGT148哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）XM_001788228F：TGAACTGGAGGCTGATGGACACR：TGACTGGCCAGCAGAGTAGGAA83真核起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）BC120290F：GGCAGGCGGTGAAGAGTCR：CCTGGGCTGCGGGAT302p70核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）DN544771F：CAAGCTTGCATGCTAATTTGTCCR：TTGAGTCCTGATCATGTCGAAGA101信号转导和转录激活因子5（STAT5）NM_001012673F：AAGACCCAGACCAAGTTCGCR：AGCACCGTGGCAGTAGCAT422Janus激酶2（JAK2）DT897449F：TGAAGAAAACAGGTAATCAGACTGGAR：AACATTTTCTCGCTCAACAGCA101真核起始因子4E（eIF4E）NM_174310.3F：GAAGACTTTTGGGCTCTGTACR：CAGCTCCACATACATCATCAC82单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPKα1）NM_001109802F：ACCATTCTTGGTTGCTGAAACTCR：CACCTTGGTGTTTGGATTTCTG801.2.2BMEC内mTOR、S6K1、4EBP1、eIF4E和AMPK的磷酸化水平BMECs培养48 h，弃掉上清液，使用PBS清洗2次，加入250 μL含有0.1% PMSF的RIPA细胞裂解液，4 ℃裂解5 min，刮取贴壁细胞，收集细胞悬液于1.5 mL Eppendorf管中，离心。以GAPDH为内参，使用Western blot方法分别测定BMEC内mTOR、S6K1、4EBP1、eIF4E和AMPK的磷酸化水平。1.3数据统计与分析所有数据采用Excel 2019进行计算和整理，SAS 9.0中双因素设计的MIXED程序分析，混合模型包括乙酸、Met主效应及乙酸与Met的互作效应。结果以“平均值和标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1乙酸与Met互作效应对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达的影响（见表2）由表2可知，0.52 mmol/L的Met组CSN1S1、CSN2和CSN3 mRNA相对表达量显著高于0.13 mmol/L组（P0.05）。0.52 mmol/L的Met组STAT5和JACK2 mRNA相对表达量显著高于0.13 mmol/L组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.018.T002表2乙酸与Met互作效应对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达的影响项目CSN1S1CSN2CSN3STAT5JACK2Met/(mmol/L)乙酸/(mmol/L)0.1301.00B1.001.00E1.00F1.00E40.62D1.361.33CD1.28F1.11E60.49E1.541.49BCD1.66DE1.49D80.17F1.421.24DE1.61DE1.46D100.17F1.231.13E1.79D1.44D120.15F1.151.13E1.55E1.45D0.5201.44A1.681.52BC1.91CD1.79CD40.95B1.801.55BC2.10C1.90C61.02B2.071.56BC2.14BC1.93C80.70D1.911.84A3.23A2.91A100.88CD1.891.51BC2.60B2.35B120.83CD1.711.65B2.48B1.99CSEM0.080.100.090.150.10主效应Met/(mmol/L)0.130.431.281.221.481.330.520.971.841.602.412.14乙酸/(mmol/L)01.22a1.34c1.26b1.46e1.39d40.78b1.58b1.44ab1.69de1.50cd60.76b1.81a1.53a1.90cd1.71b80.44c1.67a1.54a2.42a2.18a100.52c1.56b1.32b2.20ab1.89b120.49c1.43bc1.39ab2.02bc1.72bcP值乙酸0.0010.0060.0200.0010.015Met0.0010.0010.0010.0070.009乙酸×Met0.0020.8760.0500.0080.001注：同列数据肩标不同小写字母表示主效应乙酸处理间差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；不含相同大写字母表示乙酸与Met的互作效应差异显著（P0.05），含相同大写字母表示差异不显著（P0.05），下表同。乙酸浓度能够显著影响CSN1S1、CSN2、CSN3、STAT5和JACK2 mRNA相对表达量（P0.05），CSN1S1 mRNA相对表达量以0组最高，随着乙酸浓度增加依次降低；CSN2 mRNA相对表达量以6 mmol/L、8 mmol/L组较高；CSN3以4、6、8 mmol/L组和12 mmol/L组较高；STAT5和JACK2均以8 mmol/L组最高，0、4 mmol/L组较低。Met与乙酸互作效应能够显著影响CSN1S1、CSN3、STAT5和JACK2 mRNA相对表达量（P0.05），其中CSN1S1以Met浓度为0.52 mmol/L、乙酸浓度为0的组合最高；CSN3以Met浓度为0.52 mmol/L，乙酸浓度为8 mmol/L组合最高；STAT5和JACK2均以Met浓度为0.52 mmol/L、乙酸浓度为8 mmol/L组合最高。2.2乙酸与Met互作效应对BMECs内mTOR信号通路相关基因表达的影响（见表3）由表3可知，Met与乙酸处理能够显著影响eIF4E、4EBP1、S6K1和mTOR mRNA相对表达量（P0.05），0.52 mmol/L Met组显著高于0.13 mmol/L组；乙酸处理条件下，均以0组最低，其中eIF4E以4 mmol/L、10 mmol/L组较高，4EBP1以6、8、10 mmol/L组较高，mTOR以4、6、8、10 mmol/L组较高，S6K1以4~8 mmol/L组较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.018.T003表3乙酸与Met互作效应对BMECs内mTOR信号通路相关基因表达的影响项目eIF4E4EBP1mTORS6K1AMPKα1Met/(mmol/L)乙酸/(mmol/L)0.1301.001.00D1.00E1.001.00BC42.101.26D1.46BC1.411.10ABC61.671.70C1.35BC1.531.16AB81.541.56C1.16DE1.401.07ABC101.441.36CD1.02DE1.391.23A121.301.15D0.96E1.181.24A0.5201.411.44D1.30C1.321.01BC41.962.22AB1.23CD1.570.68E61.552.03B1.73A1.760.88D81.852.66A1.81A1.700.92C102.092.35B1.69AB1.420.84DE121.841.52C1.61AB1.501.15ABSEM0.120.160.100.070.07主效应Met/(mmol/L)0.131.511.341.161.321.130.521.782.041.561.540.92乙酸/(mmol/L)01.20d1.22c1.15c1.16c1.01b42.03a1.74b1.35a1.49ab0.89b61.61b1.86ab1.54a1.64a1.02b81.69b2.11a1.49a1.55a1.00b101.76ab1.85ab1.35ab1.40b1.04b121.57b1.33c1.28bc1.34b1.20aP值乙酸0.0010.0010.0010.0010.004Met0.0070.0010.0010.0010.001乙酸×Met0.1020.0290.0040.2890.026Met与乙酸互作效应能够显著影响4EBP1和mTOR mRNA相对表达量（P0.05）；其中4EBP1以Met浓度为0.52 mmol/L，乙酸浓度分别为4、6、8和10 mmol/L组合较高，mTOR mRNA相对表达量以Met浓度为0.52 mmol/L、乙酸浓度为6、8、10、12 mmol/L组合较高。Met与乙酸处理能够显著影响AMPKα1 mRNA相对表达量，其中0.52 mmol/L的Met组显著低于0.13 mmol/L组（P0.05）；乙酸处理12 mmol/L组AMPKα1 mRNA相对表达量最高。Met与乙酸互作效应能够显著影响AMPKα1 mRNA的相对表达量（P0.05），其中Met为0.52 mmol/L、乙酸为12 mmol/L组合以及Met为0.13 mmol/L，乙酸为4、6、8、10、12 mmol/L组合较高。2.3乙酸与Met互作效应对BMECs内乳蛋白合成相关蛋白表达及磷酸化水平的影响（见表4、图1）由表4、图1可知，乙酸与Met浓度能够显著影响BMECs内mTOR和S6K1的磷酸化水平（P0.05），0.52 mmol/L的 Met组显著高于0.13 mmol/L组（P0.05）；mTOR和S6K1的磷酸化水平以6~8 mmol/L乙酸组较高。乙酸与Met互作效应能够显著影响mTOR磷酸化水平（P0.05），以Met为0.52 mmol/L、乙酸为6、8、10、12 mmol/L组合，Met为0.13 mmol/L、乙酸为6 mmol/L组合mTOR磷酸化水平较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.018.T004表4乙酸与Met互作效应对BMECs内乳蛋白合成相关蛋白表达及磷酸化水平的影响项目mTOR4EBP1eIF4ES6K1AMPKMet/(mmol/L)乙酸/(mmol/L)0.1301.00E1.00CD1.00E1.001.0041.44CD1.05C1.67B1.091.0361.73A1.29A1.50C1.841.0781.55BC1.05C1.47C1.771.04101.17E0.89E0.90E1.611.08121.12E0.97D1.14E1.461.000.5201.35D1.04CD1.15D1.410.9341.40D1.07C1.42C1.530.7061.69A1.19B1.48C2.050.8881.79A1.09C1.81A1.751.06101.77A1.01CD1.68B1.571.05121.67AB1.02CD1.83A1.250.97SEM0.1460.2850.0360.0710.027主效应Met/(mmol/L)0.131.331.041.281.461.040.521.611.071.561.590.93乙酸/(mmol/L)01.18c1.02bc1.08d1.20d0.97b41.42b1.06b1.55b1.31d0.86c61.71a1.24a1.49b1.95a0.98b81.67a1.07b1.64a1.76b1.05a101.47b0.95d1.29c1.59c1.07a121.40b1.00cd1.49b1.36d0.99bP值乙酸0.0010.0010.0010.0010.001Met0.0120.0870.0010.0040.001乙酸×Met0.0010.0120.0010.0850.08910.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.018.F001图1乙酸与Met互作效应对BMECs内mTOR信号通路磷酸化水平的影响乙酸浓度能够极显著影响BMECs内4EBP1和eIF4E磷酸化水平（P0.01），4EBP1以6 mmol/L组最高，eIF4E以8 mmol/L乙酸组最高；0.52 mmol/L Met组的eIF4E磷酸化水平显著或趋于显著高于0.13 mmol/L组（P0.05）。乙酸与Met互作效应能够显著影响4EBP1、eIF4E磷酸化水平（P0.05），4EBP1以Met为0.13 mmol/L、乙酸为6 mmol/L的组合最高。eIF4E以Met为0.52 mmol/L，乙酸分别为8 mmol/L、12 mmol/L组合较高。乙酸与Met浓度能够显著影响BMECs内AMPK磷酸化水平（P0.05）。3讨论3.1乙酸与Met互作效应对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达的影响酪蛋白和乳清蛋白是牛乳蛋白主要组成成分，牛乳中的酪蛋白具有极高的营养价值，因此其含量是衡量牛奶品质的重要指标之一。牛乳中CSN1S1和CSN3是BMECs内两个主要的酪蛋白基因，其表达水平与乳蛋白合成密切相关[8-9]。研究表明，添加乙酸能够显著降低BMECs中CSN1S1丰度，6 mmol/L乙酸能够显著促进CSN1S1和CSN3 mRNA基因的表达[5-6,10]。AA是乳蛋白合成的前提物质，补充不同必需氨基酸（EAA）均能够促进乳蛋白合成。Met是乳蛋白合成过程中第一限制性氨基酸。研究表明，每天补饲1 g过瘤胃蛋氨酸组的奶山羊组产奶量、乳蛋白合成相关基因CSN1S1、CSN2、CSN3 mRNA丰度显著上调[11]。本课题组前期研究也表明，0.52 mmol/L Met组CSN2和CSN3 mRNA基因的表达水平提高最明显[7]。目前，有关乙酸与Met互作效应的研究较少。本试验结果表明，添加Met与乙酸对BMECs内乳蛋白合成相关基因具有明显的调控作用，当Met浓度为0.13 mmol/L或0.52 mmol/L时，随乙酸浓度增加，BMECs内CSN3和JACK2/STAT5的表达呈不同程度的上调效果，CSN1S1显著下降，表明补充适宜剂量的Met和乙酸可以起明显的互作效应，显著上调BMECs内乳蛋白合成相关基因的表达，进而促进乳蛋白合成，改善乳品质。3.2乙酸与Met互作效应对BMECs通过JAK2-STST5信号通路调控蛋白合成的影响BMECs内乳蛋白合成主要由JAK-STAT5和mTOR/S6K1/eIF4E 2个信号通路进行调控[12]。JAK2-STAT5信号通路是在转录水平介导催乳素和生长因子刺激乳蛋白的合成，催乳素和生长因子与BMECs上相应受体的结合导致JAK2磷酸化，进而磷酸化STAT5，磷酸化的STAT5形成二聚体进入细胞核，通过结合乳蛋白基因的启动子和增强子诱导表达，在乳腺发育和乳蛋白合成中发挥重要作用[13-14]。有研究表明，在培养基中添加15％Met-Met二肽显著增加JAK2和STST5基因的表达丰度，Met-Met能够通过激活JAK2-STST5信号通路介导奶牛乳腺CSN1S1的表达[15]。研究表明，单独添加乙酸和Met均可以上调CSN1S1、CSN3、JACK2和STAT5等乳蛋白合成相关基因mRNA的表达，促进BMECs内乳蛋白合成[4-6,16]。但有关二者在调控BMECs内乳蛋白合成过程中是否存在互作效应的研究较少。有研究表明，Leu与乙酸的互作效应可以对上述基因表达起到上调作用，进而调控乳蛋白合成[6]。本研究结果显示，Met与乙酸互作效应能够显著影响STAT5和JACK2 mRNA相对表达量，STAT5 mRNA相对表达量以Met为0.52 mmol/L，乙酸为6、8、10 mmol/L组合较高；JACK2 mRNA相对表达量以Met为0.52 mmol/L，乙酸为0、4、6、8、10、12 mmol/L组合较高。因此，可以推测Met作为乳蛋白合成的第一限制性氨基酸与乳脂合成前体物乙酸可以产生明显的互作效应，Met为0.52 mmol/L，乙酸为6、8、10 mmol/L的组合互作效应较好，可以通过激活BMECs内JAK2-STST5信号通路介导奶牛乳腺CSN1S1、CSN3表达，进而促进乳蛋白合成。3.3乙酸与Met互作效应对BMECs通过mTOR信号通路合成蛋白的影响mTOR信号通路是AA调控泌乳奶牛乳腺组织中乳蛋白合成的重要通路[17]，是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在翻译水平上通过影响mRNA与43S起始复合物的结合以及4EBP1、S6K1的磷酸化，调控细胞生长和蛋白质合成[18-20]，在奶牛乳蛋白合成翻译过程的起始及延伸阶段均发挥重要作用，并受到氨基酸水平的影响[21-22]。有研究发现，Met对BMECs内mTOR、eIF4E、4EBP1、S6K1基因相对表达量及mTOR和S6K1磷酸化水平与Met浓度呈剂量依赖关系，以0.39~0.52 mmol/L组较高[16]，表明适宜浓度的Met可以通过激活mTOR信号通路，促进BMECs内酪蛋白合成。本试验结果表明，添加不同浓度的乙酸均可显著上调BMECs内JACK2/STAT5和mTOR通路中eIF4E、4EBP1及S6K1基因表达和磷酸化水平，以6 mmol/L、8 mmol/L组较好，Met浓度为0.13 mmol/L或0.52 mmol/L时，mTOR和4EBP1的基因表达随乙酸浓度的增加呈现先增加后降低的变化规律，以Met浓度为0.52 mmol/L，乙酸浓度为6、8、10、12 mmol/L组合以及Met浓度为0.13 mmol/L、乙酸浓度为6 mmol/L组合较高。Met与乙酸互作效应显著影响4EBP1和mTOR mRNA相对表达量；其中4EBP1以Met浓度0.52 mmol/L，乙酸浓度分别为4、6、8和10 mmol/L组合较高；mTOR mRNA相对表达量以Met浓度为0.52 mmol/L，乙酸浓度为6、8、10、12 mmol/L组合较高，表明Met与乙酸的互作效应可以通过激活mTOR信号通路促进BMECs内蛋白合成，且以Met为0.52 mmol/L，乙酸为4、6、8、10 mmol/L的组合促进效果较好。mTOR信号通路上游的元件AMPK是细胞内能量的主要调节器，调节能量的供应与需求的平衡，其活性与mTOR介导的合成代谢信号通路呈负相关[23-24]，与本试验结果相同。因此，乙酸与Met相互作用促进BMECs内JACK2/STAT5的表达和mTOR内eIF4E、4EBP1及S6K1基因表达和磷酸化水平，抑制AMPK磷酸化水平，同时又影响CSN1S1和CSN3基因表达，提示二者互作效应的影响可能是通过激活JACK2/STAT5和mTOR通路影响CSN1S1和CSN3的转录与翻译水平，进而实现对乳蛋白合成的调控，但确切的机理还需要进一步探讨。4结论本试验研究表明，乙酸与Met相互作用促进BMECs内JACK2/STAT5的表达和mTOR内eIF4E、4EBP1及S6K1基因表达和磷酸化水平，抑制AMPK磷酸化水平，影响CSN1S1和CSN3的基因表达，表明二者互作效应的影响可能是通过激活JACK2/STAT5和mTOR通路影响CSN1S1和CSN3的转录与翻译水平，进而实现对乳蛋白合成的调控，以Met为0.52 mmol/L、乙酸为6 mmol/L组合促进效果较好。