辣木是一种热带、亚热带多功能植物，属于辣木科辣木属，生长迅速，在我国的广西、云南、广州、福建等地均有种植[1-2]。辣木叶、花、果实、种子均可供人类食用与利用，营养丰富，含有丰富的钙、磷、钾、铁等矿物元素和微量元素，辣木叶含25%粗蛋白质（CP），还含有丰富维生素和抗氧化等活性成分[3-4]。有研究表明，辣木茎叶可以应用于动物饲料，缓解饲料短缺问题[5]。根据辣木林间管理和辣木叶的采摘过程会产生大量的辣木茎秆粉，因为其营养价值远低于辣木叶，种植园一般直接遗弃，造成资源的损失。辣木茎秆粗纤维（CF）含量高，且含有一定抗营养成分，难以直接饲喂动物，需要寻找一种合适的方案来处理辣木茎秆粉。目前，通过菌酶协调发酵辣木茎秆粉有可能改善其适口性，同时提高其营养价值。而黑曲霉、枯草芽孢杆菌生命力强，代谢快且能够分泌多种纤维素酶、蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶等多种酶[6]。酿酒酵母是协同菌，可以利用黑曲霉或枯草芽孢杆菌产生的代谢物质，如糖类等物质，且自身代谢迅速，合成菌体蛋白效果较好，协同发酵反应向着正反应方向进行，同时可以改善饲料的适口性[7]。本研究以辣木茎秆粉为基质，探讨枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母菌和植酸酶相互作用对辣木茎秆的纤维、蛋白质含量以及抗营养因子的影响，旨在为开发辣木茎秆粉在动物饲料中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料辣木茎秆粉由广西习缘辣木有限公司提供。酿酒酵母菌（GGSF16）来自本实验室保藏菌株；黑曲霉（FCCC114002）与枯草芽孢杆菌（FSCC115037）购自广东环凯微生物科技有限公司；植酸酶（酶活为5 U/mg）购自北京索莱宝科技有限公司。1.2试剂与仪器浓硫酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、SDS、三乙二醇、羟基联苯、黄基水杨酸、植酸钠、三氯化铁等均为分析纯，购自北京索莱宝科技有限公司。PDA培养基、LB培养基均由实验室配制。K9860全自动凯氏定氮仪购自济南海能；A200i半自动纤维分析仪购自美国ANKOM Technology；SP-756P紫外分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；802B-1离心机购自江苏新康医疗器械有限公司；KQ700-DE超声波清洗仪购自深圳市深华泰超声洗净设备有限公司；FE22 pH值计购自上海梅特勒-托利多仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1菌种活化将酿酒酵母菌和黑曲霉分别接种于PDA固体培养基中，30 ℃恒温培养3 d。将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基35 ℃条件下恒温培养1 d。1.3.2种子液制备待黑曲霉在培养基上铺满整个培养皿，用适量无菌水冲洗孢子，擦镜纸过滤显微镜下计数并调节孢子悬液的浓度为1×108 CFU/mL。酿酒酵母菌用PDA液体培养基于28 ℃、200 r/min锥形瓶培养72 h，调节浓度约为1×108 CFU/mL，而枯草芽孢杆菌用LB液体培养基30 ℃、250 r/min培养48 h，调节浓度约为1×108 CFU/mL。1.3.3辣木茎秆粉发酵固态发酵的制备称取90 g辣木茎秆粉作为发酵基质，以10%的接种量添加植酸酶（A，240 U/g）、枯草芽孢杆菌（B）、黑曲霉（D）和酿酒酵母（E），再将上述菌和酶组合成双菌加酶和三菌加酶组。菌种的接种比例为1∶1和1∶1∶1，对照组则添加等量的无菌水，每个发酵罐条件保持相同。发酵基质水分为70%，在30 ℃灭菌的恒温培养箱中发酵7 d。试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T001表1试验设计组别CK组T1组T2组T3组T4组T5组T6组T7组T8组菌种无AA+BA+DA+EA+B+DA+D+EA+B+EA+B+D+E1.4测定指标及方法1.4.1发酵品质称取样品10 g，加入90 mL无菌林格氏液，玻璃棒搅拌均匀静置0.5 h后，采用pH值计测定过滤后滤液pH值、采用苯酚次氯酸钠法测定氨态氮含量[8]、采用对羟基联苯比色法测定乳酸含量[9]。1.4.2营养成分样品粗蛋白（CP）含量的测定参考GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定　凯氏定氮法》；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的测定参照GB/T 20806—2006《饲料中中性洗涤纤维（NDF）的测定》和NY/T 1459—2007《饲料中酸性洗涤纤维（ADF）的测定》；粗脂肪（EE）含量的测定采用GB/T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定》。1.4.3抗营养因子植酸采用三氯化铁比色法测定植酸含量[10]。1.5数据统计与分析采用Excel 2019对数据进行整理，采用SPSS 24.0进行差异显著性分析，试验结果均以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。2结果与分析2.1菌酶协同对辣木茎秆粉发酵品质的影响（见表2）由表2可知，T6、T7、T8组pH值显著低于CK、T1、T3、T4组（P0.05）。对照组CK与T1组乳酸含量显著低于T3-T8组（P0.05），与T6、T8组相比较，T2、T3、T4组显著降低（P0.05）。T6、T7、T8组的氨态氮含量显著低于CK、T1、T2、T3、T5（P0.05），与CK、T1、T3组相比较，T4组的氨态氮含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T002表2菌酶协同对辣木茎秆粉发酵品质的影响组别pH值乳酸/(mmol/L)氨态氮/(mg/L)CK组5.78±0.14a13.33±1.56c161.60±31.50aT1组5.82±0.18a13.18±1.88c162.60±20.30aT2组5.19±0.07ab14.82±1.02bc154.70±29.70abT3组6.04±0.11a15.87±2.72b166.60±15.20aT4组5.63±0.12a16.31±1.52b138.90±7.80bcT5组5.17±0.12ab17.32±0.59ab155.80±19.30abT6组4.65±0.10b19.89±3.16a126.60±13.20cT7组4.70±0.07b18.22±2.37ab130.60±13.30cT8组4.59±0.10b20.36±1.68a127.10±10.70c注：同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P＞0.05），不同的字母表示差异显著（P＜0.05）；下表同。2.2菌酶协同发酵对辣木茎秆粉营养成分的影响（见表3）由表3可知，T4、T5、T7、T8、组的CP含量显著高于CK、T1、T3组（P0.05）。T5、T6、T7、T8组的NDF显著低于CK、T1、T2组（P0.05），与对照组CK相比，分别降低20.11%、28.98%、26.56%、30.52%。T3-T8组ADF含量显著低于CK、T1、T2组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T003表3菌酶协同发酵对辣木茎秆粉营养成分的影响组别CPNDFADFEECK组4.23±0.17c78.12±2.83a65.12±2.55a7.26±0.42T1组4.22±0.05c78.06±3.41a59.53±4.25a7.29±0.29T2组4.33±0.10bc75.09±1.79a58.62±2.85a7.23±0.47T3组4.19±0.01c66.44±5.12bc53.12±2.96b7.43±0.79T4组4.59±0.14ab74.39±3.13a49.64±3.15c7.39±0.57T5组5.06±0.13b62.41±2.56bc53.26±1.76bc7.15±0.79T6组4.35±0.15bc55.48±1.58c44.77±4.66c6.88±0.61T7组5.75±0.10a58.37±1.75bc47.84±1.93bc7.05±0.46T8组5.60±0.16a54.28±1.84c45.62±2.55c6.93±0.32%2.3菌酶协同发酵对辣木茎秆粉抗营养因子植酸含量的影响（见表4）由表4可知，试验组T3、T4、T5、T6、T7、T8植酸含量显著低于对照组CK、T1、T2组（P0.05），T2组植酸含量显著低于CK组（P0.05），其他各组间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T004表4菌酶协同发酵对辣木茎秆粉抗营养因子植酸含量的影响项目CK组T1组T2组T3组T4组T5组T6组T7组T8组植酸19.94±0.75a18.53±1.12ab14.81±1.23b12.32±1.44c12.45±0.94c11.74±0.82c12.07±1.17c11.77±1.38c11.90±1.53c注：同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P＞0.05），不同的字母表示差异显著（P＜0.05）。g/kg3讨论3.1菌酶协同对辣木茎秆粉发酵品质的影响由pH值和乳酸含量来看，含有酵母菌的双菌组合和三菌组合发酵辣木茎秆粉效果优于单菌组和对照组，且T6与T8组发酵辣木茎秆粉效果较优，单菌发酵与对照组比较效果差异不显著。试验结果表明，黑曲霉和酿酒酵母发酵辣木茎秆粉能够降低pH值、促进乳酸菌的生长繁殖、提高乳酸含量，是因为黑曲霉和酿酒酵母菌在发酵初期进行好氧反应，发酵基质为无氧环境，促进乳酸菌的繁殖，与王梅等[11]研究基本一致。氨态氮含量变化是由蛋白质和氨基酸分解造成，其含量越低表明发酵品质越好，试验中酿酒酵母菌与黑曲霉或枯草芽孢杆菌、三菌组合的氨态氮含量都明显降低，可能是因为黑曲霉或枯草芽孢杆菌都可以产生纤维素酶，把辣木茎秆粉中大量的纤维素降解单糖或二糖，而酿酒酵母可将纤维素分解，使得微生物在发酵过程中得以进行繁殖，合成更多的蛋白质或氨基酸，减少氨态氮的产生，与其他研究结果一致[12]。3.2菌酶协同发酵对辣木茎秆粉营养成分的影响在饲料的常规营养成分中，CF、CP和EE是评价饲料品质的重要指标。研究表明，枯草芽孢杆菌发酵能显著提高辣木茎叶粉CP含量，可能是微生物生长合成的菌体蛋白升高导致，或是由于发酵过程中有机物的损失、干物质含量的下降进而导致发酵物的CP相对比例就升高的原因[13-14]。试验单一菌（枯草芽孢杆菌）并未显著提高CP含量，而是枯草芽孢杆菌与酿酒酵母菌组合显著提高CP含量，说明混菌发酵比单菌发酵辣木茎秆粉效果好。研究表明，将枯草芽孢杆菌和黑曲霉用来发酵饲料可以降低CF含量，是因为黑曲霉可以产生丰富的纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、植酸酶等大量的酶系统，有些酶能够分解植物的细胞壁，裂解植物纤维、植酸等难消化吸收的物质，去除抗营养因子，从而提高营养价值[15]。枯草芽孢杆菌具有代谢快、生命力顽强等特点，也可以产生丰富的酶。试验中，对照组自然发酵辣木茎秆粉纤维降解速率较慢，含有枯草芽孢杆菌与酿酒酵母或黑曲霉与酿酒酵母的处理组T5~T8的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维显著降低，且含有酿酒酵母菌的T6、T8组效果更明显，与其他研究结果一致[16-17]。本试验中，所选用的菌虽然可以产生脂肪酶，但处理组的粗脂肪含量并未显著的降低，可能原因是发酵物辣木茎秆粉的pH值呈现酸性，在此环境下脂肪酶的活性不高，所以粗脂肪的分解效果不明显。3.3菌酶协同发酵对辣木茎秆粉抗营养因子植酸含量的影响据报道，辣木含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质以及抗氧化物质；但同时辣木也含有单宁、植酸、皂苷、总酚等抗营养因子，破坏动物机体对营养物质的吸收，辣木叶中植酸含量高达55 g/kg[14]。试验选用的辣木茎秆粉植酸也高达20 g/kg。本试验中，把植酸酶直接加入辣木茎秆粉发酵，植酸有一定程度的降低，但差异不显著，可能是因为此微环境条件下植酸酶活性不高。而含有黑曲霉的组合中植酸含量都有显著的降低，且含有黑曲霉的混菌比含有黑曲霉的单菌发酵辣木茎秆粉植酸降低效果更好，可能是因为单菌发酵辣木茎秆粉产生的酶不如混菌产生酶完善，混菌组合加快微生物代谢，提高菌体蛋白的合成，提高辣木茎秆粉的CP含量，改善发酵品质。4结论试验从提高CP、乳酸含量，降低纤维、抗营养因子植酸含量等方面来评价单菌加酶或混合菌加酶发酵的方式对辣木茎秆粉营养成分的影响。研究发现，三菌加酶发酵优于双菌加酶发酵效果，双菌加酶发酵优于单菌加酶发酵的效果，综合考虑用枯草芽孢杆菌+黑曲霉+酿酒酵母菌+植酸酶来发酵辣木茎秆粉的效果更优。