目前，复合酸化剂作为饲料添加剂在动物生产中应用较多。复合酸化剂一般由有机酸或其盐类按一定比例组成，在抑菌、缓解应激、增强免疫和抗病力等多种作用方面优于单一酸化剂。近年来，在鱼类饵料中添加复合酸化剂可以促进鱼类生长，如提高黄河鲤（Cyprinus carpio）[1]、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[2]、罗非鱼（Oreochromis niloticus）[3]的生长性能，改善肠道内微生物群系[4]。体外抑菌研究表明，复合酸化剂可抑制大肠杆菌和链球菌等多种致病菌增殖[5-7]、黄曲霉生长[8]，甲酸与丙酸混合物还能够有效抑制鱼粉中大肠杆菌增殖[9]。目前，多采用传统方法评价复合酸化剂的抑菌效果，使用高通量菌群测序方法比较全面分析复合酸化剂对饲料中细菌抑制效果的研究较少。鱼类饵料中菌群在不同的温度下贮存过程中的变化情况也鲜见报道。本试验在鱼粉比例较高的鳗鲡饵料中添加不同水平的复合酸化剂，利用16S rDNA高通量测序法分析贮存于不同温度条件下鳗鲡饵料菌群的变化，探究复合酸化剂对饵料菌群的作用效果，为科学贮存配合饵料、促进复合酸化剂在饵料中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料黑仔鳗粉状饵料（未添加任何形式的酸化剂）由福州欣瑞意实业有限公司提供，主要营养成分（实测值）为粗蛋白47.57%、粗脂肪5.60%、粗灰分14.07%、水分7.32%。复合酸化剂由泰高营养科技（北京）有限公司提供（商品名为“加强型肥酸宝”），总酸含量为43.2%，原料组成为复合有机酸及铵盐（甲酸、甲酸铵、乙酸、丙酸、山梨酸、乳酸、柠檬酸）和脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸和月桂酸），载体为硅酸。1.2试验设计在鳗鲡商业饵料中分别添加0、3.0和6.0 g/kg的复合酸化剂，分别贮存于常温（20 ℃）和高温（40 ℃）条件下60 d，常温条件下的饵料分组为RTS0组（未添加复合酸化剂）、RTS3组（添加复合酸化剂3.0 g/kg）、RTS6组（添加复合酸化剂6.0 g/kg）；高温条件下的饵料分组为HTS0组（未添加复合酸化剂）、HTS3组（添加复合酸化剂3.0 g/kg）、HTS6组（添加复合酸化剂6.0 g/kg），每组设5个重复。1.3样品采集与饵料菌群分析复合酸化剂与饵料逐级混匀，分别装入标有不同编号的密封袋中，置于不同温度条件下贮存60 d，从每个重复饵料中取10 g样品进行菌群分析。参照黄媛等[10]的方法，使用DNA Kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）试剂盒提取肠道总DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度法（260 nm/280 nm光密度比）进行质量检测。根据16S rDNA V3-V4区扩增引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'），进行PCR扩增。扩增结束后，PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，采用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒纯化，通过Illumina Miseq PE300平台进行Paired-end测序。本试验中饵料菌群测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。1.4数据统计与分析采用QIIME version v.1.8平台计算不同处理组菌群的alpha多样性参数，Python v2.7软件进行LEfSe分析（常温和高温下LDA Score的筛选值分别为2.0和2.5，P0.05），结果以“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1不同温度条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群α多样性的影响（见表1）由表1可知，常温条件下保存60 d，各组鳗鲡饵料菌群α多样性指标差异不显著（P0.05）。高温条件下保存60 d，HTS0组、HTS3组饵料菌群的Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数差异不显著（P0.05）；HTS6组的Chao1指数、Ace指数和Shannon指数显著高于HTS0组和HTS3组（P0.05），Simpson指数显著低于HTS0组和HTS3组（P0.05）。各组鳗鲡饵料菌群测序的覆盖率均达到99%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.016.T001表1不同温度条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群α多样性的影响组别Chao1指数Ace指数Shannon指数Simpson指数覆盖率/%RTS0组1 380.34±51.54b1 358.43±38.62b4.96±0.05b0.017±0.001a99.37RTS3组1 379.55±45.26b1 360.56±20.72b4.97±0.02b0.017±0.000a99.34RTS6组1 350.21±97.62b1 323.44±67.68b4.94±0.04b0.017±0.001a99.36HTS0组1 362.59±45.08b1 342.86±51.99b4.97±0.05b0.017±0.001a99.31HTS3组1 361.34±82.62b1 351.61±68.56b4.96±0.03b0.017±0.001a99.32HTS6组1 748.87±50.17a1 780.30±63.31a5.19±0.09a0.015±0.001b99.10注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2不同温度条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群门水平上组成的影响（见图1、图2）由图1、图2可知，不同温度下各处理组饵料样品在门水平上菌群组成类似，以变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota）等为优势菌群。各鳗鲡饵料菌群门水平上的组成及相对丰度接近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.016.F001图1常温条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群门水平上组成的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.016.F002图2高温条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群门水平上组成的影响2.3不同温度条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群属水平上组成的影响2.3.1常温条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群属水平上组成的影响（见图3）由图3可知，RTS0组芽孢杆菌属（Gemmobacter）、交替赤杆菌属（Altererythrobacter）、Mariniflexile、玫瑰单胞菌属（Roseomonas）、氢噬胞菌属（Hydrogenophaga）相对丰度增加。RTS3组Solibacillus、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、细杆菌属（Anaerofilum）、Marinimicrobium相对丰度增加。RTS6组Savagea、Rummeliibacillus相对丰度增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.016.F003图3常温条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群属水平上组成的影响2.3.2高温条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群属水平上组成的影响（见图4）由图4可知，HTS0组伦黑墨氏菌属（Rheinheimera）、红球菌属（Rhodococcus）、假单胞菌（Pseudomonas）、乳杆菌属（Laceyella）、弧菌属（Vibrio）、短杆菌属（Brevibacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、硫膨大杆菌属（Thioclava）相对丰度增加。HTS3组鸟氨酸微菌属（Ornithinimicrobium）相对丰度增加。HTS6组不动杆菌属（Acinetobacter）、嗜蛋白质菌属（Proteiniphilum）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、Sedimentibacter、氢孢菌属（Hydrogenispora）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、Petrimonas Caldicoprobacter相对丰度增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.016.F004图4高温条件下添加不同水平复合酸化剂的鳗鲡饵料菌群属水平上组成的影响3讨论3.1不同温度条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群α多样性的影响在研究菌群α多样性指标中，Chao1指数和Ace指数通常用于估计物种总数，表示生态系统中细菌种类的丰富程度。Shannon指数和Simpson指数均是衡量菌群种类多样性的指标，Shannon值越大和Simpson指数越小均表明菌群的多样性越高[11-12]。本研究中，常温和高温条件下，各组的Shannon指数接近，表明常温和高温条件下复合酸化剂对饵料菌群多样性无影响。而高温条件下添加6.0 g/kg复合酸化剂使饵料菌群丰度和多样性增加，表明高温添加下添加复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群的影响较大。不同组样本菌群测序的覆盖度均在99%以上，表明样本未被测量的概率较低，本次测序结果可反映鳗鲡饵料样本的真实情况[13]。3.2不同温度条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群门水平上组成的影响本试验中，常温和高温条件下，各组鳗鲡饵料菌群在门水平上菌群种类及组成接近。鳗鲡饵料菌群中的优势菌以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）为主，其中变形菌门占比较高，与花鳗鲡[14]、欧洲鳗鲡幼鱼[15]和美洲鳗鲡白仔苗[16]肠道中优势菌的组成相似，表明饵料中菌群可能对摄食该饵料的水生动物肠道菌群的组成起主要作用。3.3不同温度条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群属水平上组成的影响3.3.1常温条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群属水平上组成的影响本试验中，RTS0组芽孢杆菌属（Gemmobacter）、交替赤杆菌属（Altererythrobacter）、Mariniflexile、玫瑰单胞菌属（Roseomonas）、氢噬胞菌属（Hydrogenophaga）相对丰度增加。一些芽孢杆菌可以作为益生菌广泛应用于水产养殖中，其能够增强宿主免疫力及对致病性弧菌的抵抗能力[17]；交替赤杆菌属具有生物降解、产类胡萝卜素、产细胞毒素和产酶等功能，是潜在的益生菌[18]。玫瑰单胞菌为潜在致病菌，目前国内外对玫瑰单胞菌的研究十分有限，但已有的研究皆表明其具有致病性[19]。Mariniflexile属和氢噬胞菌属在水产动物中的研究鲜见报道，具体功能还有待进一步研究。本研究结果显示，RTS3组Solibacillus、Pseudoalteromonas、Anaerofilum、Marinimicrobium相对丰度增加。有些假交替单胞菌属菌种是公认的益生菌，对哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）等多种病原体有拮抗作用，能够分泌多种胞外活性物质，抑制多种细菌生长[20-21]。细杆菌属属于厚壁菌门[22]，Marinimicrobium属于交替单胞菌科，可在细胞外生产新型耐盐、热稳定和碱稳定的羧甲基纤维素酶[23]。Solibacillus鲜有在鱼类肠道或体外的相关报道，其具体作用还有待一步研究。本研究结果显示，RTS6组Savagea、Rummeliibacillus相对丰度增加。Savagea是一种对泰乐菌素和四环素具有抗性的细菌[24]，Rummeliibacillus是一种潜在益生菌，可改善尼罗罗非鱼生长性能及机体健康[25]。因此，在常温条件下，无复合酸化剂添加的鳗鲡饵料中存在较高丰度的潜在致病菌，添加一定水平的复合酸化剂后，饵料pH值降低，抑制了有害微生物增殖和生长，同时改善益生菌的增殖及组成，降低鳗鲡饵料菌群中致病菌的相对丰度。3.3.2高温条件下添加不同水平复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群属水平上组成的影响本试验中，HTS0组伦黑墨氏菌属（Rheinheimera）、红球菌属（Rhodococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、乳杆菌属（Laceyella）、弧菌属（Vibrio）、短杆菌属（Brevibacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、硫膨大杆菌属（Thioclava）相对丰度增加。伦黑墨氏菌属对大肠杆菌等致病菌具有抗菌作用[26]；乳杆菌属的嗜酸乳杆菌[27]和植物乳杆菌[28]可提高水生动物抗病能力；短杆菌属是一种具有抑菌作用和抗逆性优良的饲用芽孢杆菌[29]。但也存在一些致病菌，如红球菌属是人和动物的致病菌[30]；弧菌属是感染海水鱼的病原菌[31]；假单胞菌属为条件致病菌，能够引起鱼类细菌性疾病[32]。链霉菌属、高温放线菌属、罗尔斯通氏菌属和硫膨大杆菌属还鲜见在鱼类肠道内或体外的有关报道。本研究结果显示，HTS3组鸟氨酸微菌属（Ornithinimicrobium）的相对丰度增加，HTS6组饵料中不动杆菌属（Acinetobacter）、嗜蛋白质菌属（Proteiniphilum）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、Sedimentibacter、氢孢菌属（Hydrogenispora）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、Petrimonas和Caldicoprobacter相对丰度增加。鸟氨酸微菌属对大肠杆菌、鳗弧菌等致病菌具有一定抑制作用[33]；不动杆菌属可有效预防病原菌感染，产生消化酶和抑制鳗弧菌的物质[16]；嗜蛋白质菌属的成员产乙酸嗜蛋白质菌（Proteiniphilum acetatigenes）是一种产酸菌，主要产物是乙酸和丙酸[34]。而慢生根瘤菌属、Sedimentibacter、氢孢菌属、嗜冷杆菌属、Petrimonas和Caldicoprobacter在水生动物中的报道较少，具体作用有待进一步研究证明。温度是影响微生物菌群活动的重要因素，高温可促进腐败菌增殖。本试验中，在常温和高温条件下，无添加复合酸化剂的鳗鲡饵料菌群中潜在致病菌种类及丰度较高，且高温条件下饵料中菌群多样性升高。添加复合酸化剂后，常温和高温条件下饵料中致病菌的丰度均降低，益生菌的丰度增加；且复合酸化剂的添加水平不同，益生菌的组成也存在差异。高温条件下添加复合酸化剂鳗鲡饵料菌群中还出现了产酸菌大量繁殖，且酸性环境有利于益生菌的繁殖。因此，可以推断高温条件下复合酸化剂的抑菌作用更为明显。使用琼脂平板打孔法、牛津杯法、试管二倍稀释法和平板培养法等常规方法评价复合酸化剂对细菌或真菌的抑制效果的相关研究较多[5-8]。本试验采用16S rDNA高通量测序方法研究不同温度下复合酸化剂对鳗鲡饵料菌群的影响，测序菌群的种类远高于传统方法，可更深入地揭示复合酸化剂的抑菌效果。但本试验中复合酸化剂添加水平设置梯度不多，其在高温贮存条件下对饵料菌群产生最佳效果的添加水平有待进一步研究，兼顾养殖动物生长及肠道健康产生正面效果的添加水平，从而在鱼类饵料中合理使用复合酸化剂。4结论本研究结果显示，在常温和高温条件下，鳗鲡饵料中添加3.0 g/kg、6.0 g/kg复合酸化剂后，潜在致病菌相对丰度降低，潜在益生菌的组成及相对丰度发生变化，尤其在高温条件下添加6.0 g/kg复合酸化剂效果最佳。