滩羊由放牧转变为舍饲化养殖后，运动量下降，且饲草种类单一，造成滩羊育肥后胴体脂肪过度沉积、个体免疫力下降等[1]。瘤胃是反刍动物特有的消化器官，反刍动物可通过瘤胃中细菌、原虫和真菌发酵分解饲料，获取日粮中的营养物质[2]。瘤胃中各种微生物相互作用，能够影响瘤胃中蛋白质、脂肪等沉积与纤维素的降解速率，改善反刍动物消化功能[3]。研究发现，运动能够促进动物肠道菌群改变，如改变菌种丰度和菌群多样性[4-5]。Choi等[6]研究发现，运动小鼠体内含有大量乳杆菌，其肠球菌属数量约为不运动小鼠的24倍，而运动小鼠软壁菌属中部分菌群含量显著低于不运动小鼠，表明运动能够抑制小鼠致病菌生长，促进了鼠肠道有益菌群发展。Kang等[7]研究发现，运动增加了小鼠肠道内有益菌属厚壁菌门和拟杆菌门的丰度。目前关于有氧运动对反刍动物瘤胃微生物丰度的影响报道较少，本试验旨在利用宏基因组技术分析有氧运动对滩羊瘤胃微生物丰度的影响，为舍饲滩羊养殖生产出健康、绿色的滩羊肉提供参考。1材料与方法1.1试验设计与试验日粮选取滩羊母羔羊60只，随机分成3组，每组20个重复，每个重复1只羊。10 km组羊除每日在圈舍自由活动外，沿生态牧场运动跑道有氧运动行走10 km；5 km组羊除每日在圈舍自由活动外，沿生态牧场运动跑道有氧运动行走5 km；NC组（对照组）羊每日在圈舍自由活动。各组试验羊佩戴北斗定位器，记录每日运动轨迹及行走路程，试验期6个月。各组滩羊饲喂相同日粮，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.003.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米52.0代谢能/(MJ/kg)13.07玉米秸秆16.0粗蛋白质/%13.97苜蓿11.0粗纤维/%14.80豆粕8.0粗脂肪/%6.55DDGS6.0粗灰分/%6.55麸皮3.0钙/%0.47食盐1.0磷/%0.34预混料3.0注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 8 000 IU、VD 1 000 IU、VE 20 IU、五水硫酸铜46.8 mg、碘酸钙2.88 mg、一水硫酸亚铁257.22 mg、一水硫酸锰130.5 mg、六水氯化钴1.44 mg、一水硫酸锌135.54 mg、酵母硒71.84 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.2样品采集试验结束后，各组随机选取6只试验羊屠宰，30 min内将瘤胃内容物使用4层纱布过滤，取过滤液12 mL分装于10 mL冻存管，放入液氮罐中速冻，送至实验室。其中一管于-20 ℃保存，用于微生物DNA的提取与检测；另取一管于-80 ℃超低温冰箱保存。1.3测定指标及方法1.3.1宏基因组DNA提取及建库测序1.3.1.1DNA提取使用DNA提取试剂盒（HiPure Stool DNAKits，上海芃硕生物科技有限公司）从瘤胃内容物中提取基因组DNA，具体操作严格按照DNA Kit的标准规范进行，提取后的DNA使用1%琼脂糖电泳、NanoPhotometer微量分光光度计（美国Implen）和Qubit2.0 Flurometer核酸浓度检测仪器（美国Life Technologies）进行DNA浓度与质量的检测。全部样品DNA总量均大于1 μg，OD260 nm/OD280 nm≥1.8，条带未见降解，提取后样品于-80 ℃下保存。1.3.1.2文库构建与测序每个样本使用1 μg DNA作为模板，使用NEBNext ULtra TM DNA Library Prep Kit forIllumina试剂盒进行文库构建。1.3.1.3上机测序Agilent 2100生物分析仪和实时荧光定量PCR（real-time PCR）以进行文库质量检测与定量，取10 ng的文库，使用MiSeq Ｒeagent Kit v3（美国Illumina Inc）在Illumina MiSeq中进行双向测序，测序在上海伟寰生物科技有限公司进行。1.3.2宏基因组数据预处理1.3.2.1数据过滤与去除宿主污染使用软件Trimmomatic（v0.32）对原始数据进行过滤，去除含适配器的数据，去除N的比例大于10%的数据，去除低质量数据（质量值Q≤20的碱基数占整个数据的40%以上），得到有效数据。将有效数据与bosTau8宿主基因组数据库比对，比对软件为bowtie2，得到有效数据用于后续分析。1.3.2.2序列组装利用MEGAHIT软件对有效序列进行组装，并在不同估计基因组长度下组装数据获得重叠群。1.3.3微生物多样性与功能分析利用MetaGeneMark对大于500 bp的重叠群进行开放阅读框预测，采用CD-HIT软件对符合条件（95%多样性，90%覆盖率）的预测基因进行聚类。获得非冗余基因集后，使用KEGG orthology数据库（版本67.1）进行分级功能分类。将得到的可用序列整理到Excel表格中，计算每个水平微生物或功能在每个样本中的相对比例，进行统计分析。1.4数据统计与分析使用SPSS 25.0分析软件对所得数据进行正态分布检验，符合正态分布后进行单因素方差分析。采用多项式对比，LSD法对组间差异进行多重比较。结果以“平均值和标准误”表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1有氧运动滩羊瘤胃微生物测序数据统计结果（见表2）试验共收集15只滩羊瘤胃内容物样本进行宏基因组分析，将测序后得到的原始数据进行过滤，进一步去除宿主污染后得到最终有效序列。由表2可知，10 km组平均获得82 871 056条最终有效序列，5 km组平均获得93 718 905条最终有效序列，NC组平均获得102 927 768条最终有效序列。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.003.T002表2有氧运动滩羊瘤胃微生物测序数据统计结果项目原始数据有效序列宿主映射序列最终有效序列10 km组83 254 72582 888 00816 58082 871 0565 km组94 13334593 753 11733 66293 718905NC组103 536 045102 954 63726 208102 927 768SEM19 508 87219 469 88026 06519 464 906P值0.1510.1560.4930.1572.2有氧运动对滩羊瘤胃微生物组成结构OTU Venn图（见图1）由图1可知，15例瘤胃样本在种水平上共出现了8 354个OTU，3组样本共有6 821条相同标识，分别占各组样品OTU的91.42%（10 km组）、88.29%（5 km组）、92.43%（NC组）。10 km组独有247条标识，5 km组独有476条标识，NC组独有241条标识。研究表明，5 km组滩羊瘤胃菌群种类变化最大，10 km组次之。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.003.F001图1有氧运动对滩羊瘤胃微生物组成结构OTU Venn图2.3有氧运动对育肥期滩羊瘤胃微生物丰度的影响（见表3）由表3可知，门水平上，与NC组相比，10 km组滩羊瘤胃酸杆菌门显著升高（P0.05），5 km组滩羊瘤胃疣微菌门、变形菌门丰度显著高于NC组（P0.05），10 km组滩羊瘤胃厚壁菌门丰度为各组中最高，NC组最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.003.T003表3有氧运动对育肥期滩羊瘤胃微生物丰度影响项目10 km组5 km组NC组SEMP值酸杆菌门0.193a0.163b0.155b0.0060.027疣微菌门0.227ab0.272a0.208b0.0120.019变形菌门20.744ab22.835a18.675b0.8330.021放线菌门10.33411.5179.2090.6680.402厚壁菌门27.44426.35225.1521.7260.881红细菌科0.958ab1.160a0.750b0.0700.046假单胞菌科1.537ab1.730a1.331b0.0750.046Muri菌14.85912.47021.0312.5350.392乳酸杆菌科0.8911.0091.9160.2890.306类芽孢杆菌科1.6441.6621.3280.1010.346类芽孢杆菌属1.5241.5581.3300.6940.377瘤胃球菌属1.0302.4980.3420.5000.207Muri菌10861015.955ab13.291b22.551a2.7530.027栖瘤胃普雷沃氏菌6.8955.2234.7370.6440.595埃氏巨球型菌1.3900.5190.8890.1300.207月形单胞菌9200.787a0.296b0.563ab0.0970.012注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。科水平上，与NC组相比，5 km组滩羊瘤胃红细菌科、假单胞菌科显著升高（P0.05），10 km组假单胞菌科丰度为各组中最低，NC组为最高，各组间呈阶梯状变化。在属、种水平上，与NC组相比，5 km组滩羊瘤胃Muri菌108610丰度显著降低（P0.05）；与5 km组相比，10 km组滩羊瘤胃月形单胞菌920丰度显著升高（P0.05），10 km组滩羊瘤胃栖瘤胃普雷沃氏菌丰度为各组中最高，NC组为最低。2.4有氧运动对育肥期滩羊瘤胃微生物丰富度和多样性的影响2.4.1有氧运动对育肥期滩羊Alpha多样性的影响（见表4）由表4可知，10 km组、5 km组滩羊瘤胃内容物Shannon指数、Chao1指数均高于NC组，表明10 km组、5 km组的样本菌群多样性均高于NC组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.003.T004表4有氧运动对育肥期Alpha多样性的影响项目Shannon指数Simpson指数Chao1指数10 km组6.0350.9656 609.25 km组6.0280.9556 684.2NC组5.5710.9506 561.6SEM0.1480.00933.751P值0.3720.2950.3522.4.2有氧运动对育肥期滩羊瘤胃Beta多样性的影响（见图2、图3）由图2可知，每日有氧运动10 km组滩羊菌群坐标值更趋近，而5 km组与NC组显示较分散，可见每日育肥期滩羊每日有氧运动10 km可提高滩羊个体间肠道微生物相似性，有利于促进滩羊肠道微生物群落的稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.003.F002图2PCoA分析结果由图3可知，通过Anosim是非参数检验，计算R值和P值，结果发现，组间差异大于组内差异，组间差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.003.F003图3种水平Anosim分析结果2.5有氧运动对育肥期滩羊种水平差异菌的影响（见图4）基于Kruskal-Wallis方法，判断各个类群在不同分组之间的丰度差异。由图4可知，与NC组相比，10 km组反刍兽新月单胞菌、埃氏巨型球菌、月形单胞菌oral taxon 126、月形单胞菌oral taxon 920、月形单胞菌oral taxon 478、月形单胞菌oral taxon 136、制服拟杆菌、另枝菌、酸热脂环酸杆菌、瘤胃球菌CPB6、嗜酸乳杆菌、类芽孢杆菌UniB2、类芽孢杆菌12200R-189丰度增加；5 km组甲烷短杆菌丰度增加，10 km组、5 km组脱硫弧菌丰度降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.003.F004图4种水平差异菌组间比较结果3讨论研究表明，运动是影响肠道菌群丰度变化的一个独立因素[8]，其对产生短链脂肪酸的肠道菌群的丰度和调控短链脂肪酸产生的相关基因表达具有重要影响。本试验中，在种水平上共出现了8 354个OTU，3组样本共有6 821条相同标识，分别占10 km组样品OTU的91.42%，5 km组样品OTU的88.29%，NC组样品OTU的92.43%。10 km组独有247条，5 km组独有476条，NC组独有241条。每日有氧运动组滩羊瘤胃菌群丰度增加表明长期规律性运动同样影响着肠道菌群的丰度[9]。本试验通过PCoA分析发现，10 km组菌群坐标值更趋近，而5 km组与NC组显示较分散，可见育肥期滩羊每日有氧运动10 km可提高滩羊个体间肠道微生物相似性，提示滩羊每日有氧运动10 km有利于促进滩羊肠道微生物群落的稳定。瘤胃是反刍动物体内最大的生态系统，瘤胃菌群具有维持瘤胃正常生理功能的作用。瘤胃菌群作为反刍动物体内庞大而复杂的微生物系统，对反刍动物瘤胃消化及发酵过程起到重要作用。研究发现，运动能够使体内肠道菌群更加多样化，促进有益菌群生长，抑制病原菌发展[10]。Bressa等[11]、Clapke等[12]、Kulecka等[13]研究发现，运动可使肠道菌群在组成和种属结构上存在明显差异。舍饲滩羊的精细化和集约化饲养程度越来越高，为提高舍饲滩羊生产效率，饲喂滩羊高精料以及大量易发酵碳水化合物日粮，致使滩羊瘤胃内淀粉分解菌及一些既能分解纤维又能分解淀粉的菌株大量增殖，容易导致瘤胃酸中毒[14]，进而严重危害动物健康[15]。研究表明，栖瘤胃普雷沃氏菌可降解蛋白质、纤维素、半纤维素、木聚糖、寡糖、淀粉等物质[16]，埃氏巨型球菌与反刍兽新月形单胞菌是瘤胃中两种主要的乳酸利用细菌，能够将乳酸转化为乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸，进而被瘤胃上皮吸收转运至肝脏氧化供能，在瘤胃乳酸代谢中起到重要作用[17-18]。本试验中，运动组滩羊瘤胃中栖瘤胃普雷沃氏菌、埃氏巨型球菌与反刍兽新月形单胞菌为优势菌种，瘤胃中栖瘤胃普雷沃氏菌丰度增加后，可提高瘤胃中糖代谢的能力，埃氏巨型球菌与反刍兽新月形单胞菌丰度增加后提高了瘤胃乳转化能力，为动物机体提供更多可吸收的营养物质，阻止瘤胃酸中毒发生，与Fiuza-Luces等[19]研究结果一致。动物肠道中脱硫弧菌代谢产物可导致肠道疾病的发生，被视为肠道中的有害细菌[20]。本试验中，运动组滩羊瘤胃中脱硫弧菌丰度较对照组降低，可见运动后滩羊瘤胃有害菌降低，可减少肠道疾病发病。4结论本试验结果表明，舍饲滩羊连续6个月每日有氧运动10 km可提高瘤胃中有益菌反刍兽新月单胞菌、埃氏巨型球菌、埃氏巨型球菌、酸热脂环酸杆菌、类芽孢杆菌UniB2的丰度，降低有害菌脱硫弧菌丰度，提高瘤胃中糖代谢的能力，增强瘤胃中乳酸转化为挥发性脂肪酸，为肝脏氧化供能，降低瘤胃有害菌丰度，进而减少肠道疾病发生。