在饲用抗生素禁用的背景下，在动物日粮中添加益生菌是提高动物生产性能、改善健康水平的重要途径之一[1-2]。益生菌制剂主要分为乳酸菌制剂、芽孢杆菌制剂、酵母类制剂[3-4]。干酪乳杆菌属于乳酸杆菌属，是《饲料添加剂品种目录（2013）》规定允许应用于养殖动物饲料生产的微生物[5]。干酪乳杆菌具有促进脂质代谢[6]，提高机体免疫[7]，改善肠道[8]等功能，能够提高畜禽生产性能[9-10]，在动物生产中具有较高的应用研究价值。但目前干酪乳杆菌在我国蛋鸡养殖中的应用较少。因此，本试验旨在研究添加不同水平的干酪乳杆菌制剂对海兰褐蛋鸡生产性能、血清生化指标及肠道微生物的影响，为干酪乳杆菌在蛋鸡养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验动物为（27.0±0.5）周龄、生产水平一致的健康海兰褐蛋鸡，总计20 000羽，由山东枣庄富阳蛋鸡养殖专业合作社提供。干酪乳杆菌微生物制剂购自山东微昂生物科技有限公司，含量为1×1010 CFU/g。1.2试验设计随机将海兰褐蛋鸡分为4组，每组5个重复，每个重复1 000羽蛋鸡。A组（对照组）、B组、C组、D组分别在基础日粮中添加0、30、60、90 mg/kg干酪乳杆菌。基础日粮参考NRC（2012）和《产蛋鸡和肉鸡配合饲料》（GB/T 5916—2020）制定，基础日粮组成及营养水平见表1。预试期1 w，正式试验期8 w。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.013.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米60.58代谢能/(MJ/kg)11.43豆粕22.44粗蛋白/%16.46花生粕2.87赖氨酸/%0.69鱼粉1.54蛋氨酸/%0.35磷酸氢钙1.38钙/%3.56石粉8.52有效磷/%0.54DL-蛋氨酸0.22沸石粉1.12食盐0.33预混料1.00注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 11 000 IU、VD3 3 500 IU、VE 30 IU、VB12 0.04 mg、叶酸4.0 mg、烟酸 31.5 mg、生物素2.0 mg、硫氨酸 0.5 mg、核黄素6.5 mg、吡哆醇5.6 mg、Cu 6.5 mg、Fe 53 mg、Zn 55 mg、Mn 62 mg、I 0.3 mg、Se 0.2 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理试验鸡使用笼养饲喂，饲养密度为2只/笼。鸡舍主要光源为自然光与人工补光，光照时长约16 h，光照强度约25 lx，空气湿度约55%。保证鸡舍内部通风良好，温度为22~25 ℃。保证试验鸡自由采食、饮水。试验鸡日常保健、免疫程序依照养殖场规定处理。1.4测定指标及方法1.4.1生产性能以重复为单位，记录每日产蛋数、蛋重、死淘数与耗料量，试验结束后统计试验阶段的产蛋率、平均蛋重、平均日采食量及料蛋比。产蛋率=产蛋总数/(试验鸡数×试验天数)×100%(1)平均日采食量=总采食量/(试验鸡数×试验天数)(2)平均日产蛋重=总蛋重/(试验鸡数×试验天数)(3)料蛋比=总采食量/总蛋重(4)1.4.2蛋品质试验最后1 d，各重复选择1枚接近该组平均蛋重的鸡蛋，测定鸡蛋蛋壳强度与厚度、蛋黄色泽与质量、蛋白质量及哈夫单位等指标。采用CHDK-01型蛋壳强度检测仪（济南初创机电设备有限公司）检测蛋壳强度；螺旋测微器（东莞市杰皓切削工具有限公司）测定蛋壳厚度；MHY-N25L型蛋品质分析仪（北京美华仪科技有限公司）测定哈夫单位、蛋黄颜色；电子天平测量蛋白与蛋黄重量。1.4.3血清指标饲喂试验结束后，每个重复中随机选择1只蛋鸡，静脉采血5 mL，3 500 r/min离心5 min，取上清液，置于-20 ℃保存。测定的抗氧化指标为：血清总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GHS-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。测定的免疫指标为：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）。血清指标试剂盒均购自艾博抗（上海）贸易有限公司，具体操作步骤参考试剂盒说明。1.4.4盲肠微生物饲喂结束后，各重复随机选择1只蛋鸡屠宰，取下盲肠，置于-20 ℃冰箱中保存。参考谭子超等[11]的方法，精确称量肠道内容物0.5 g，将其放入含4.5 mL无菌生理盐水的离心管中，使用微型振荡器摇匀，此为10-1倍稀释液；将10-1倍稀释液离心，取上清液0.5 mL，置于含4.5 mL无菌生理盐水的离心管中，使用微型振荡器中摇匀得到10-2倍稀释液，重复上述直至稀释至10-7倍，得到细菌稀释液用于后续培养。乳酸杆菌使用LBS琼脂培养基在37 ℃厌氧条件下培养48 h，大肠杆菌使用EMB琼脂培养基在37 ℃有氧条件下培养24 h，双歧杆菌使用BS琼脂培养基在37 ℃厌氧条件下培养48 h，沙门杆菌使用HE琼脂在37 ℃有氧条件下培养24 h。各菌种设置3个重复。培养试验完毕，分别统计各微生物数量。1.4.5养分表观消化率饲喂试验结束后，各重复随机挑选1只试验鸡用于为期3 d的代谢试验。每日收集粪便2~3次，去除粪便中羽毛、饲料及其他杂物，使用10%盐酸固定，将各重复粪便样品充分混合均匀，置于密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存。粪便样品置于65 ℃烘箱中烘干，置于常温回潮，粉碎，过40目筛片，得风干粪样；将日粮粉碎，过40目筛，同样制得饲料风干样品。参考张丽英[12]的方法测定样品中干物质、能量、粗蛋白、粗脂肪、钙、磷的含量，计算养分表观消化率。养分表观消化率=100%-100%×(饲料中盐酸不溶灰分含量×粪样中养分含量)/(饲料中养分含量×粪样中盐酸不溶灰分含量)(5)1.5数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行初步整理，SPSS 24软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1干酪乳杆菌对蛋鸡生产性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，各试验组蛋鸡平均日采食量显著上升（P0.05），但试验组间差异不显著（P0.05）；C组、D组蛋鸡的平均日产蛋重显著升高（P0.05）；D组产蛋率显著升高（P0.05），料蛋比显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.013.T002表2干酪乳杆菌对蛋鸡生产性能的影响组别平均日采食量/[g/(只·d)]平均日产蛋重/[g/(只·d)]产蛋率/%料蛋比A组（对照组）109.46±1.98b55.47±1.94b90.12±1.13b1.97±0.03aB组113.27±2.01a56.38±3.41ab91.45±1.18ab2.01±0.04abC组113.85±1.84a59.81±2.07a92.87±1.02ab1.90±0.06abD组114.46±1.74a60.59±1.81a93.46±1.27a1.89±0.04b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2干酪乳杆菌对蛋品质的影响（见表3）由表3可知，随着日粮中干酪乳杆菌的添加量上升，各组蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋壳重量及蛋黄重量呈上升趋势，但差异不显著（P0.05）。与对照组相比，C组、D组蛋鸡蛋白重量显著升高（P0.05）；各试验组鸡蛋的哈夫单位显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.013.T003表3干酪乳杆菌对蛋品质的影响组别蛋壳强度/(kg/m2)蛋壳厚度/mm蛋黄色泽蛋壳重量/g蛋白重量/g蛋黄重量/g哈夫单位A组（对照组）4.12±0.420.32±0.086.21±0.777.48±0.5632.43±2.53b15.76±2.1981.32±1.96bB组4.16±0.390.33±0.076.32±0.717.52±0.6933.08±2.18b16.43±1.9388.51±2.57aC组4.17±0.320.35±0.066.38±0.597.75±0.4637.86±1.89a16.89±2.5187.83±2.81aD组4.21±0.450.38±0.066.46±0.637.86±0.5338.02±2.07a17.02±2.6387.17±2.06a2.3干酪乳杆菌对蛋鸡血清指标的影响2.3.1干酪乳杆菌对蛋鸡血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，各试验组蛋鸡血清GSH-Px、SOD活性以及T-AOC均显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.013.T004表4干酪乳杆菌对蛋鸡血清抗氧化指标的影响组别T-AOC/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)CAT/(U/mL)SOD/(U/mL)MDA/(μmol/L)A组（对照组）2.34±0.47c387.86±24.37c1.35±0.42128.76±11.35b4.76±0.82B组3.57±0.59b435.31±30.44b1.39±0.35148.47±9.17a4.43±0.61C组3.89±0.61b452.39±39.81ab1.38±0.27156.08±11.22a4.35±0.58D组4.79±0.52a502.67±28.41a1.41±0.43150.39±13.40a4.06±0.652.3.2干酪乳杆菌对蛋鸡血清免疫指标的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，D组蛋鸡血清IgG含量升高（P0.05）。各组蛋鸡血清IgA、IgM、TNF-α及IL-6的含量差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.013.T005表5干酪乳杆菌对蛋鸡血清免疫指标的影响组别IgG/(g/L)IgA/(g/L)IgM/(g/L)TNF-α/(ng/L)IL-6/(ng/L)A组（对照组）3.27±0.25b0.61±0.071.28±0.2717.43±2.8113.48±2.19B组3.58±0.37b0.63±0.121.25±0.3417.57±2.0112.57±1.97C组3.89±0.33ab0.64±0.051.36±0.1917.28±3.1013.06±2.81D组4.10±0.27a0.68±0.131.32±0.2118.42±3.3513.50±2.462.4干酪乳杆菌对蛋鸡肠道微生物的影响（见表6）由表6可知，C组、D组蛋鸡盲肠中大肠杆菌数量显著降低（P0.05）；各试验组蛋鸡盲肠中乳酸杆菌数量显著升高（P0.05），沙门氏菌数量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.013.T006表6干酪乳杆菌对蛋鸡肠道微生物的影响组别大肠杆菌乳酸杆菌沙门氏菌双歧杆菌A组（对照组）8.73±0.16a7.92±0.10d6.65±0.13a7.42±0.22B组8.68±0.13a8.23±0.13c6.24±0.08b7.46±0.14C组8.30±0.11b8.59±0.12b6.28±0.09b7.39±0.21D组7.86±0.23c9.01±0.09a6.19±0.13b7.41±0.18lgCFU/g2.5干酪乳杆菌对蛋鸡养分表观消化率的影响（见表7）由表7可知，试验各组蛋鸡的干物质表观消化率显著高于对照组（P0.05），但各试验组间差异不显著（P0.05）。各组蛋鸡能量、粗蛋白、粗脂肪的表观消化率随着干酪乳杆菌添加水平的上升呈上升趋势，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.013.T007表7干酪乳杆菌对蛋鸡养分表观消化率的影响组别干物质能量粗蛋白粗脂肪钙磷A组（对照组）51.42±2.38b65.93±6.3251.87±4.3653.48±6.6644.58±4.2742.38±3.67B组55.49±2.01a67.43±5.8153.28±3.6753.98±4.8743.69±3.8143.27±2.88C组56.27±1.94a68.43±5.2054.36±4.0154.07±5.2744.72±4.6342.07±3.13D组57.38±2.33a69.38±4.3154.86±6.2555.63±5.0445.19±3.0542.97±2.41%3讨论3.1干酪乳杆菌对蛋鸡生产性能的影响Lokapirnasari等[13]为研究益生菌替代饲用抗生素的潜力，在30周龄蛋鸡基础日粮中分别添加1%双歧杆菌、1%干酪乳杆菌和混合益生菌制剂（0.5%双歧杆菌+0.25%干酪乳杆菌），并以基础日粮组为对照组，结果发现，试验各组蛋鸡的采食量、饲料转化率及产蛋率等指标均优于对照组，且以混合益生菌制剂组蛋鸡生产性能最高，其中平均采食量达到112.15 g/d，产蛋率约为86.78%，认为益生菌具有替代饲用抗生素的潜力，并且双歧杆菌和干酪乳杆菌联合使用效果更佳。Najwan[14]在大肠杆菌感染的蛋鸡饮水中添加1×109 CFU/mL干酪乳杆菌和乳酸乳球菌混合菌种，结果发现，使用益生菌可以提高感染大肠杆菌的蛋鸡采食量，提升饲料转化率，且蛋鸡产蛋量和蛋重显著提升。本研究发现，在日粮中单独添加干酪乳杆菌可以提高蛋鸡各项产蛋性能，尽管使用方法存在差别，但结果与上述研究结论基本一致。3.2干酪乳杆菌对蛋品质的影响蛋壳强度、蛋壳厚度是影响蛋品质的重要指标[15]，蛋黄色泽与哈夫单位反映鸡蛋的新鲜度，而蛋黄与蛋白等重量与鸡蛋营养价值有关。Lokapirnasari等[16]在日本鹌鹑日粮中分别添加10 mg/kg抗生素、50 mg/kg干酪乳杆菌、100 mg/kg干酪乳杆菌，以基础日粮为对照组，另设饮水中加入50 g/L干酪乳杆菌组和100 g/L干酪乳杆菌组以观察干酪乳杆菌对鹌鹑蛋蛋品质的影响，结果表明，各试验组蛋的重量、长度、宽度及蛋壳重量、厚度显著高于对照组；试验各组蛋黄的颜色、高度、宽度、长度和蛋白高度、宽度、长度、指数及哈夫单位均高于对照组，100 g/L干酪乳杆菌组蛋品质指标优于抗生素组。目前，关于干酪乳杆菌改善蛋品质的报道相对偏少，但有研究表明，同属乳酸杆菌属且使用成本相对较低的副干酪乳杆菌KL1可以改善蛋鸡生产性能且可以提高蛋壳强度与厚度，提高蛋黄重量增强鸡蛋营养价值[17]。本研究结果表明，干酪乳杆菌在日粮中的添加量与蛋品质改善效果呈一定的剂量效应，但具体的作用机制仍需进一步研究。3.3干酪乳杆菌对蛋鸡血清抗氧化指标的影响T-AOC、GSH-Px、SOD等抗氧化相关指标可反映机体内部抗氧化能力，MDA水平可以反映机体内部脂质过氧化反应的程度，直接反映机体健康水平[18]。免疫球蛋白是机体主动免疫的重要物质，反映了机体应对疾病的抵御能力[19]。研究表明，乳酸杆菌属益生菌可以有效提高动物机体抗氧化能力和免疫性能[20-22]。Safari等[23]在斑马鱼饵料中分别添加0、1×105、1×106及1×107 CFU/g的干酪乳杆菌，各试验组斑马鱼血清中免疫球蛋白、溶菌酶含量均显著高于对照组；且饲喂干酪乳杆菌可以促进体内免疫基因（TNF-α和LYZ）、抗氧化基因（SOD和CAT）的表达，表明干酪乳杆菌可以通过影响抗氧化酶及免疫相关基因的表达改善动物机体健康。Zhang等[24]在肉鸡基础日粮中分别添加1%干酪乳杆菌、1%嗜酸乳杆菌和1%双歧杆菌，在试验第21 d和42 d，试验组肉鸡血清中T-AOC及SOD、GSH-Px活性和免疫器官指数显著上升，且SOD和T-AOC改善比例较高；且所有干酪乳杆菌和双歧杆菌组肉鸡血清MDA含量均显著低于对照组。本研究结果显示，干酪乳杆菌可以提高蛋鸡血清抗氧化能力，但对蛋鸡血清MDA含量无显著影响，可能是生理状态不一致所引起。饶泽斌等[10]使用琼脂块包埋的5×109 CFU干酪乳杆菌代田株，发现断奶仔猪肝脏和血清CAT活性显著上升，与本研究结果不一致。因此，使用干酪乳杆菌可以提高动物机体抗氧化能力，但具体的作用效果与物种、生理状态等因素存在关联。3.4干酪乳杆菌对蛋鸡血清免疫指标的影响IgG主要生物学功能为抗菌、抗病毒及抗感染，是血清中主要的免疫球蛋白；IgM可以激活补体；IgA具备IgG和IgM类似的生物学功能；IL-6和TNF-α是参与细胞各种炎症的炎性因子，可以反映体内炎症水平[25-26]。Deng等[27]以7日龄雏鸡口服1×109 CFU/mL沙门氏菌构造感染模型作为阳性对照，设置未感染模型作为阴性对照，在沙门氏感染后雏鸡基础日粮中添加1×108 CFU/g的干酪乳杆菌作为试验组，结果表明，干酪乳杆菌可以提高感染雏鸡的平均日增重、降低腹泻率，还可使感染雏鸡血清IgA、IgM和IgG维持较高水平，有助于改善鸡感染沙门氏菌后的健康水平。伊淑帅等[28]在雏鸡饮水中添加干酪乳杆菌（1×109 CFU/L）、氟苯尼考（浓度为0.1%），发现干酪乳杆菌组试验鸡外周血IgG含量、盲肠sIgA含量以及外周血淋巴细胞增殖能力显著高于对照组，而添加氟苯尼考显著抑制了雏鸡的免疫水平。因此，该研究认为添加干酪乳杆菌对提高雏鸡免疫力有益。本研究认为，日粮中添加干酪乳杆菌可以显著提高蛋鸡血清IgG含量，与上述研究结果基本类似，表明日粮中添加干酪乳杆菌可以提高鸡的免疫性能。3.5干酪乳杆菌对蛋鸡肠道微生物的影响益生菌可以与肠道内有害微生物产生竞争作用而抑制其增殖，产生多种活性物质与代谢产物，以改善宿主肠道功能与机体健康[29]。王四新等[30]在北京黑猪日粮中添加2×109 CFU/g的干酪乳杆菌，与对照组相比，干酪乳杆菌组试验猪空肠中厚壁菌门和链球菌属的相对丰度显著提高，变形菌门、Terrisporobacter和埃希氏菌属-志贺氏菌属相对丰度显著降低；试验组猪结肠中拟杆菌门、乳杆菌属和未标记拟杆菌目S24-7群的相对丰度显著提高，链球菌属的相对丰度显著降低，表明干酪乳杆菌可改变肠道内微生物结构。李晨博[31]研究发现，日粮中添加干酪乳杆菌可以改变猪盲肠食糜微生物的多样性。本研究表明，日粮中添加干酪乳杆菌可以抑制蛋鸡盲肠病原微生物增殖，但目前相关报道较为欠缺，仍需进一步研究。3.6干酪乳杆菌对蛋鸡养分表观消化率的影响日粮中养分表观消化率体现其营养价值的利用程度，与蛋鸡生产性能和健康密切相关，也是衡量蛋鸡对营养物质消化吸收的重要指标[32]。日粮中添加益生菌可以抑制肠道内病原微生物增殖，其代谢过程中将未消化部分饲料转化为多肽、维生素等小分子物质更易被肠道吸收，从而提高养分的表观消化率[2]。王四新等[33]在育肥猪日粮中添加混合益生菌制剂（2.0×109 CFU/kg干酪乳杆菌和2.0×108 CFU/kg酿酒酵母），与对照组相比，益生菌组试验猪粗蛋白等养分表观消化率具有提升趋势，但差异不显著，与本研究基本一致。但目前关于单独使用干酪乳杆菌改善动物日粮养分表观消化率的研究仍需进一步研究。4结论本研究结果表明，日粮中添加干酪乳杆菌可以改善蛋鸡生产性能、蛋品质及对营养物质的利用率，并通过提高机体抗氧化能力、免疫性能及抑制肠道病原微生物增殖，以维持蛋鸡机体健康，且效果随添加量上升而显著提高。综合各项指标，建议在蛋鸡日粮中添加90 mg/kg的干酪乳杆菌制剂。