目前，我国蛋白质饲料紧缺的现象日趋明显[1]。固态发酵饲料能够提高饲料利用率，缓解饲料资源供需矛盾，促进节能减排[2-3]。固态发酵饲料的营养特性取决于发酵菌种、底物和发酵条件等[4]，其中菌种是固态发酵饲料的关键因素[5]。固态发酵饲料一般为多菌种发酵[6]，因此探究固态发酵饲料发酵过程中各发酵菌种的数量变化对保证固态发酵饲料的质量和稳定性具有重要意义。目前，多采用传统的平板计数法确定固态发酵饲料中发酵菌株的数量，该方法仅根据菌落形态对菌种进行划分，操作误差大、耗时长、灵敏度低，无法准确、快速地反映各菌株在发酵过程中的动态变化[7-8]。随着科学技术发展涌现出许多分子生物学新技术，提高了检测的灵敏度和准确性[9]。PCR技术以其检测速度快、灵敏度高、无污染、特异性强、重复性好、检测时间短而得到广泛应用[10-12]。因此，利用qPCR技术检测玉米皮固态发酵过程中各菌种数量的动态变化符合生产需要且具有重大实际意义。本研究旨在构建基于qPCR技术的玉米皮固态发酵过程中枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌快速且准确地定量检测技术体系，为玉米皮菌体蛋白饲料固态发酵工艺优化提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂玉米皮由内蒙古阜丰生物有限公司提供，固态发酵玉米皮菌体蛋白饲料由本课题组制备。SYBR Green Realtime PCR Mix试剂盒、PCR Master Mix、DNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司，PCR引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司，核酸染料购自大连宝生生物有限公司。1.2培养基LB培养基：酵母提取粉5.0 g、氯化钠10.0 g、蛋白胨10.0 g、蒸馏水1 L，pH值7，115 ℃灭菌30 min。YPD培养基：酵母提取粉10.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨20.0 g、蒸馏水1 L，pH值7，115 ℃灭菌30 min。1.3引物序列根据菌株的16S/18S测序结果进行引物特异性设计，标准菌株特异性引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.T001表1标准菌株特异性引物序列项目引物序列（5'→3'）片段长度/bp枯草芽孢杆菌F：TCACCTCCCATCGCAATACGR：GGCACCGCCAAGCATAAGTC200酿酒酵母F：TGAGGTTGCTGCTTTGGTR：GGTGTCTTGGTCTACCGA120产朊假丝酵母F：AACCAAGCAAGTTTTCCACR：CTCCGAGGCCTGGGTTTGGTCTATGTTGCT3001.4测定指标及方法1.4.1玉米皮菌体蛋白饲料制备将玉米皮90%、硫酸铵5%、磷酸二氢钾2%、氯化钠2%、硫酸镁1%、发酵剂108 CFU/mL与灭菌的蒸馏水按以上比例混合，以枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌为发酵剂制备玉米皮菌体蛋白饲料，并在0、12、24、36、48、72、96、120 h取样分析，每次取样10 g，置于真空袋中，-20 ℃密封保存。1.4.2传统平板计数法准确称取玉米皮菌体蛋白饲料样品5 g于100 mL离心管中，加入45 mL生理盐水，加入5 g玻璃珠，涡旋振荡5 min，300xg离心（SIGMA 2-16K冷冻离心机，德国SIGMA公司）5 min，收集上清，重复收集3次，得到10-1稀释菌液；将上述稀释菌液与生理盐水按1∶9比例充分混合（100 μL稀释菌液于900 μL生理盐水），即为10-2稀释菌液；重复如上操作，即得10-3~10-9稀释菌液。在超净工作台中，吸取50 μL上述稀释液于配制好的固体选择性培养基中，选取合适的稀释梯度进行无菌涂布，每组设置3个平行，进行倒置培养。利用菌落计数仪计数30~300个菌落的平板，即得玉米皮菌体蛋白饲料样品中各菌种的数量。1.4.3基因组DNA提取1.4.3.1样品DNA的提取取1.2.2节中的10-1稀释梯度的混合菌液各1 mL，分别使用细菌基因组提取试剂盒和酵母基因组提取试剂盒进行样品DNA提取，操作步骤按照试剂盒说明书进行。1.4.3.2标准菌株DNA提取收集菌体，分别使用细菌和真菌基因组DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母菌的基因组DNA，具体操作步骤按照说明书进行。1.4.4标准菌株活化将-70 ℃冰箱的甘油菌，经解冻后分别涂布于对应的固体培养基上，37 ℃恒温倒置培养24~48 h，分别挑取单菌落至对应的液体培养基中，37 ℃、180 r/min摇床恒温培养，至菌液的OD600 nm达到0.8，用作发酵种子液。1.4.5引物的特异性验证对各标准菌株基因组DNA使用普通梯度PCR仪（美国BIO-RAD公司）进行交叉常规PCR反应，常规PCR反应体系（20 µL）：DNA模板1.0 µL、上游引物（10 µmol/L） 0.5 µL、下游引物（10 µmol/L） 0.5 µL、2×Taq PCR MasterMix 8.0 µL、ddH2O 10.0 µL。1.4.6标准品的制作以1.4.3.2中获得的基因组DNA，使用表1的特异性引物进行常规PCR扩增，扩增体系同1.4.5，经切胶、回收、纯化得到相应菌种的标准品，测定标准品DNA浓度和纯度，参考文献[13]根据公式将标准品DNA浓度换算为质粒DNA拷贝数，于-20 ℃保存。拷贝数=DNA的含量×10-9×6.023×1 023/(660×碱基数)(1)1.4.7qPCR扩增及方法的建立使用CFX96荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）进行qPCR反应，qPCR反应体系（20 µL）：DNA模板1.0 µL、上游引物（10 µmol/L） 0.4 µL、下游引物（10 µmol/L） 0.4 µL、SuperReal PreMix Plus （SYBR Green） 10.0 µL、ddH2O 8.2 µL。试验分别设计了枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的特异性引物，利用交叉常规PCR扩增验证其特异性，在此基础上经PCR扩增、回收、纯化等操作得到对应标准菌株的标准品，上机进行荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线、标准曲线和熔解曲线，初步建立荧光定量qPCR法。利用荧光定量PCR法和传统平板计数法测定玉米皮固态发酵菌体蛋白饲料中各菌种的数量变化，得到各菌株活菌数与拷贝数随时间变化的曲线，通过线性拟合确定两者间存在的数量关系，探究玉米皮菌体蛋白饲料固态发酵过程中菌群的变化规律。1.4.8发酵饲料样品中特异性菌株的定量PCR分析将获得的标准品DNA使用ddH2O进行10倍梯度稀释，按照表1中的特异性引物与1.2.7中反应体系进行qPCR扩增。分别提取发酵饲料样品中的DNA，以标准品DNA为阳性对照模板，以ddH2O为阴性对照模板，按表1中特异性引物进行qPCR扩增，对发酵饲料样品中各菌种进行定量分析。1.4.9线性方程的建立和线性关系验证分别对6组不同发酵时期的玉米皮菌体蛋白饲料样品进行qPCR检测和平板计数，将qPCR检测结果所得数值通过线性回归方程计算得出预期活菌数，结合实际平板计数所得数值得出对应的相似度，数学模型验证线性关系的准确性。1.5方法应用在验证方法的可行性前提下，进行玉米皮菌体蛋白饲料固态发酵过程中菌群的定量快速检测，探究多菌种固态发酵发酵过程中不同接种量下的菌群规律，以期在菌群变化规律的基础上确定最佳发酵工艺。1.6数据统计与分析分别于发酵的3个不同位置取样进行荧光定量试验，设置3个平行试验。试验数据采用SAS 2.0软件进行方差分析，Origin 2021和Excel软件进行处理与分析。2结果与分析2.1qPCR方法的建立2.1.1标准菌株基因组DNA提取结果验证各标准菌株的DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F001图1各标准菌株的DNA琼脂糖凝胶电泳结果注：M为Marker，1、2、3、4为标准菌株基因组DNA条带；图2与此同。由图1可知，各图中DNA条带清晰明亮，均大于15 000 bp，表明已成功提取枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母基因组DNA。2.1.2标准菌株引物与反应体系验证结果标准菌株特异性引物常规PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图2可知，扩增条带清晰、明亮，无拖带现象，并与所设计片段大小一致，符合试验要求[14]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F002图2标准菌株特异性引物常规PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果2.1.3标准菌株引物特异性验证标准菌株引物特异性验证琼脂糖凝胶电泳结果见图3。由图3可知，获得3个单独的条带，条带清晰明亮，均只与对应引物有特异性扩增，且条带大小与扩增片段大小一致，表明所用引物具有特异性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F003图3标准菌株引物特异性验证琼脂糖凝胶电泳结果注：M为Marker，1为枯草芽孢杆菌基因组DNA+枯草芽孢杆菌引物扩增条带，2为枯草芽孢杆菌基因组DNA+酿酒酵母引物扩增条带，3为枯草芽孢杆菌基因组DNA+产朊假丝酵母物扩增条带，4为空条带，5为产朊假丝酵母基因组DNA+枯草芽孢杆菌引物扩增条带，6为产朊假丝酵母基因组DNA+酿酒酵母引物扩增条带，7为产朊假丝酵母基因组DNA+产朊假丝酵母引物扩增条带，8为空条带，9为酿酒酵母基因组DNA+枯草芽孢杆菌引物扩增条带，10为酿酒酵母基因组DNA+酿酒酵母引物扩增条带，11为酿酒酵母基因组DNA+产朊假丝酵母引物扩增条带，12为空条带。2.1.4各标准曲线的建立结果2.1.4.1标准菌株扩增曲线结果（见图4）由图4可知，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母菌的扩增曲线整体平行性较好，指数期明显，拐点清晰，可以用于荧光定量标准曲线的绘制[14]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F004图4标准菌株扩增曲线结果2.1.4.2标准菌株标准曲线绘制结果（见图5）由图5可知，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的标准曲线方程分别为y=-3.679x+35.445，R2=0.998 7；y=-3.737x+37.254，R2=0.995 4；y=-3.483x+34.302，R2=0.998 8。该标准曲线的相关系数R2均大于0.990 0，扩增效率（E）均在90%~110%内，可以作为本试验样品检测的标准[13,15]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F005图5标准菌株标准曲线绘制结果2.1.4.3标准菌株熔解曲线结果（见图6）由图6可知，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母菌的熔解曲线均为单峰，表明扩增产物单一，无非目的条带和二聚体的产生。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F006图6标准菌株熔解曲线结果2.2qPCR与平板计数法检测发酵饲料发酵过程中菌群的对比结果（见图7）由图7可知，两种方法检测玉米皮菌体蛋白饲料样品中各菌种数量的变化趋势一致。由图7（a）可知，发酵饲料中的枯草芽孢杆菌数量在0~48 h缓慢上升，随后保持平缓，qPCR法和平板计数法检测的枯草芽孢杆菌数量在48 h达到最大值，分别为8.463 lgcopies/g和5.375 lgCFU/g。由图7（b）可知，发酵饲料中的酿酒酵母菌数量在0~12 h迅速上升，随后保持平缓，qPCR法和平板计数法检测的菌数在12 h达到最大值，分别为8.769 lgcopies/g和7.058 lgCFU/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F007图7qPCR与平板计数法检测发酵饲料发酵过程中菌群的对比结果由图7（c）可知，产朊假丝酵母菌呈下降趋势，并在72 h后保持平缓。研究表明，枯草芽孢杆菌和酵母菌间存在一定的竞争关系，可能由于枯草芽孢杆菌能够利用玉米皮中的纤维素和半纤维素，而酵母菌只能利用枯草芽孢杆菌产生的单糖物质，导致枯草芽孢杆菌成为玉米皮固态发酵饲料发酵过程中的优势菌群。随着发酵的进行，qPCR检测结果高于平板计数法，原因可能是qPCR不能区分活细胞和死细胞的DNA信号，所以无法区分死菌和活菌[16]。Fujimoto等[17]在检测粪便中短乳杆菌的数量的试验中发现，由于存在一定数量的死细胞，导致荧光定量PCR所得结果偏高。Cho等[18]在定量植物乳杆菌时发现，qPCR结果高于平板计数。2.3各菌株的线性回归方程的建立（见图8）由图8可知，两种检测方法所建立的线性回归方程分别为：y=1.301x-5.139、y=2.257x-8.431和y=2.941x-12.940，皮尔森系数（r）均大于0.94，表明两者之间存在线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F008图8各菌株的线性回归方程的建立结果2.4不同发酵时期发酵玉米皮的模型验证结果（见表4）由表4可知，相似度均在94%以上，表明本试验所建立的qPCR检测技术可应用于玉米皮菌体蛋白饲料样品中菌群数量的检测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.T002表4不同发酵时期发酵玉米皮的模型验证结果项目xy平板计数/(lgCFU/g)相似度/%样品19.1826.8076.56196样品28.9996.5696.32496样品36.5686.3935.98394样品46.3145.8205.53295样品57.2036.9946.89099样品67.0916.8796.77398注：样品1和样品2检测枯草芽孢杆菌的数量，样品3和样品4检测酿酒酵母菌的数量，样品5和样品6检测产朊假丝酵母菌的数量。2.5荧光定量PCR法和平板计数法检测不同接种量下的菌群变化规律结果（见图9）由图9（a）可知，接种量为5%、10%、15%酿酒酵母菌的生长趋势一致，均为先降低后升高，发酵至72 h，20%、25%接种量下的酿酒酵母活菌数呈先上升过后下降的趋势；接种量为15%，发酵至72 h，酿酒酵母活菌数持续升高，72 h达到最大值，为9.166 lgCFU/g。15%接种量虽在12 h活菌数略有下降，但24 h后，酿酒酵母活菌数均高于其他接种量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.022.F009图9荧光定量法和平板计数法检测不同接种量下的菌群变化规律结果由图9（b）可知，所有接种量的产朊假丝酵母菌数量与酿酒酵母生长趋势基本一致，5%、10%和15%接种量的样品均为先下降后上升，20%和25%接种量的样品均为先上升后下降，接种量为15%的产朊假丝酵母活菌数虽在0~12 h呈现下降趋势，但12 h之后活菌数持续升高，并在72 h达到最大值9.094 lgCFU/g，均高于其他接种量的产朊假丝酵母活菌数。由图9（c）可知，接种量为5%、10%的玉米皮固态发酵饲料样品中的枯草芽孢杆菌拷贝数在发酵过程中生长趋势一致，均为先降低后升高，发酵至72 h，15%、20%和25%接种量下的枯草芽孢杆菌活菌数趋于平稳上升状态，但在12~24 h内出现小幅度的下降趋势；接种量为15%，枯草芽孢杆菌拷贝数均高于其他组，呈先升高后降低，最后保持缓慢上升的趋势，在48 h达到峰值，为8.532 lgcopies/g。由图9（d）可知，接种量为5%、10%酿酒酵母拷贝数在0~24 h呈缓慢下降趋势，随后保持缓慢上升趋势直至发酵结束；接种量为15%、20%和25%酿酒酵母拷贝数在接种后均呈现先急速上升后下降的趋势并在24~72 h内保持平缓；接种量为15%时，酿酒酵母活菌数在发酵过程中均高于其他接种量。由图9（e）可知，接种量为5%的产朊假丝酵母拷贝数一直呈缓慢下降趋势直至发酵结束，10%的产朊假丝酵母拷贝数在接种后呈现先降低后升高趋势，在72 h达到最大值5.77 lgcopies/g，接种量为15%、20%和25%的产朊假丝酵母拷贝数在0~12 h内迅速上升，并在12 h达到峰值，分别为6.198、5.767、5.922 lgcopies/g，随后一直在一定范围内波动。本试验中，使用平板计数法检测酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的活菌数与SYBR Green荧光定量PCR法检测的变化趋势一致；接种量为5%、10%、15%的玉米皮固态发酵饲料样品的菌种数量在发酵前12 h呈下降趋势，随后开始生长繁殖导致菌种数量迅速上升，但20%和25%接种量的玉米皮固态发酵饲料样品的菌种数量在前12 h进行大量生长繁殖，随后呈缓慢生长直至发酵结束，其中接种量为15%的玉米皮固态发酵饲料样品的菌种数量总体上高于其余接种量的样品，因此选定15%为最佳发酵接种量。3讨论本试验采用实时荧光定量法和平板计数法对发酵饲料发酵过程中菌群的动态变化进行比较分析，所得枯草芽孢杆菌标准曲线为y=-3.679x+35.445（R2=0.998 7，E=93.3%）；酿酒酵母标准曲线方程为y=-3.737x+37.254（R2=0.995 4，E=93.2%）；产朊假丝酵母标准曲线方程为 y=-3.483x+34.302（R2=0.998 8，E=95%），根据食品和饲料转基因检测分析方法最低性能要求，实时聚合酶链式反应方法的标准曲线应在-3.1和-3.6范围内，对应的聚合酶链式E为80%至110%，标准曲线的R2系数应大于或等于0.98，满足上述条件的标准曲线，可应用于菌株的定量分析[15]。采用这一方法对固态发酵过程中混合菌群进行定量，虽然变化趋势一致，但高于平板计数的数值，原因是荧光定量PCR是基于PCR扩增为基础的分子生物学手段，而发酵饲料样品中既存在活细胞也有死细胞，这些细胞的DNA仍可以作为qPCR扩增的模板，导致假阳性结果产生[19]。研究发现，单叠丙酸丙啶（PMA）作为一种新型的核酸结合染料，可穿过受损的细胞膜进入细胞内，并与DNA结合，可使死亡细胞的DNA不被作为qPCR扩增的模板，排除死亡细胞DNA的影响[20]。本试验中，线性回归方程显示两种方法所得结果的相似度均超过94%，表明本试验所建立荧光定量PCR检测方法可用于预测玉米皮固态发酵饲料中混合菌群的数量，应用qPCR技术对发酵菌群定量可行。本试验中，根据发酵过程中出现的峰值判断，荧光定量qPCR法检测15%接种量时的枯草芽孢杆菌拷贝数分别是5%、10%、20%和25%接种量时，枯草芽孢杆菌拷贝数的1.012倍、1.035倍、1.085倍、1.074倍；15%接种量时的酿酒酵母菌拷贝数分别是5%、10%、20%和25%接种量时枯草芽孢杆菌拷贝数的1.103倍、1.184倍、1.173倍、1.083倍；15%接种量时的产朊假丝酵母菌拷贝数分别是5%、10%、20%和25%接种量时枯草芽孢杆菌拷贝数的1.269倍、1.059倍、1.121倍、1.256倍。与平板计数法相比准确性一致，但过程更简洁快速。李婷婷[21]使用荧光定量PCR检测玉米秸秆生物饲料中的菌群变化规律，同样体现出该方法的准确性。传统的微生物培养方法用时长、灵敏度低[22-23]，无法准确检测生物饲料中微生物的变化情况，而实时荧光定量操作简单省时并有较强的特异性和灵敏性，所得结果与平板计数差异较小，优势明显，可作为研究生物饲料固态发酵过程中混合菌群动态变化的工具。4结论综上所述，本试验所采用的3种菌的引物特异性较强，线性关系和扩增效率均较好，qPCR法测定玉米皮固态发酵菌体蛋白饲料中菌群精确度更高、更省时省力。