植物精油是植物的次生代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗寄生物、抗氧化、免疫调节和促进生长等功能，可防止饲料霉变和霉菌毒素产生[1]，防止饲料氧化酸败[1]，提高动物免疫性能[2]，改善动物生长性能[2]。柠檬香茅（Cymbopogon citratus）为禾本科香茅属多年生草本植物，分布于世界热带和亚热带地区[3]。香茅精油含量较高，具有抗氧化[4-5]、抑菌[5-6]和抗炎[4]等药理活性，其在饲料防霉保质、畜禽低抗和无抗养殖中具有重要的潜在应用价值。柠檬香茅精油的主要成分为柠檬醛（60%~80%）[7]，柠檬醛可以通过破坏细胞壁和质膜结构、氧化还原系统，损伤线粒体和核DNA，使黄曲霉等霉菌菌丝体细胞死亡、孢子失去萌发力而被杀死[8]，进而防止饲料霉变。Souza等[9]研究发现，80 mL/L微胶囊香茅精油对大肠杆菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌具有很好的抗菌作用，精油与饲料混合存放7 d仍保持活性，饲料品质稳定。Tartrakoon等[10]发现，在基础日粮中添加5 mL/kg香茅精油有助于提高仔猪的饲料转化率，添加2.5 mL/kg和5 mL/kg香茅精油组的猪粪便评分优于饲喂其他日粮组。Ghanima等[11]研究发现，日粮中添加300 mg/kg香茅精油能够增加肉鸡体重和日增重，改善肉类成分，提高细胞免疫，降低血清脂质、总胆固醇、甘油三酯、尿素、尿酸的含量。香茅精油成分复杂，各组分的挥发特性和贮藏稳定性存在差异。Tugiyanti等[12]研究发现，日粮中香茅油含量为0.6%时，可降低鹌鹑蛋中27.26%脂肪和5.22%胆固醇。因此，香茅精油对饲料安全贮存和畜禽健康养殖具有重要价值，研究贮存时间和容器对精油挥发性物质组成的影响，对精油的科学保存、品质鉴定、安全应用具有重要意义。本试验采用顶空-气相色谱-质谱联用技术对不同贮存时间和贮存容器的柠檬香茅精油进行挥发性成分分析，为香茅精油产品的保存及开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料柠檬香茅（Cymbopogon citratus）种植于福建省农业科学院亚热带农业研究所国家闽台特色作物种质资源圃（N24°33′7″，E117°44′24″），于2016年5月连续晴朗3 d后刈割，粉碎，提取精油。1.2测定指标及方法1.2.1精油提取采用水蒸气蒸馏法[13]测定精油得率，取200 g粉碎鲜草，放入1 000 mL的圆底烧瓶，加入400 mL水，烧瓶上接挥发油测定器，挥发油测定器的上端口接冷凝管，使用电热套炉对烧瓶进行加热，水沸腾后蒸馏2 h，从挥发油测定器上端放出精油，所得精油使用乙醚萃取，取乙醚层，把乙醚挥干，即得精油，多次提取精油合并。1.2.2精油的贮存与取样设计将2016年5月提取的新鲜精油进行挥发性成分测定外，其余分装于两种不同的精油瓶，每瓶均装入8 mL的香茅精油，于阴凉处室温贮存。一种精油瓶为茶色带内塞的螺纹平顶盖玻璃精油瓶（10 mL），保存6瓶，于3年后（3 a）和6年后（6 a）分别取3瓶，测定挥发性成分；另一种为茶色玻璃滴管瓶（10 mL），保存3瓶，于6 a后测定挥发性成分。试验样品根据贮存容器和时间分为4组：提取当年（新鲜提取精油）、3 a（内塞瓶）、6 a（内塞瓶）、6 a（滴管瓶）。1.2.3挥发性成分吸取0.5 mL精油放入20 mL的顶空瓶，使用含硅胶垫的铝盖密封。每个精油样品3个重复，放入TriPlus 300顶空自动进样器（美国赛默飞世尔科技公司）。顶空瓶静态平衡时间为3 min，炉温75 ℃。通过Trace1300-TSQ 9000气质联用仪（美国赛默飞世尔科技公司）测定挥发性成分。采用TG-5SILMS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm石英毛细管柱）进行气相色谱分析。气相色谱升温程序：起始温度50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升温至160 ℃，以10 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min；进样量1 000 μL，载气为氦气，体积流量1.2 mL/min，分流比10∶1。质谱条件：电离方式为电子轰击型离子源，离子源温度300 ℃，接口温度280 ℃。扫描质量范围为30~550 amu。1.2.4挥发性成分鉴定各组分质谱经NIST检索，使用人工谱图分析以确定各化学成分，采用峰面积归一法计算各成分相对百分含量。1.2.5挥发性成分相似率参照王华夫等[14]的方法计算挥发性成分相似率。S(A,B)=∑i=1naibi∑i=1nai2∑i=1nbi2 (1)式中：S（A,B）为样品A、B之间的相似率；ai、bi为样品A、B各香气成分的含量（%）。1.3数据统计与分析采用SPSS 19.0软件对试验数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同贮存时间和容器条件下的柠檬香茅精油峰面积和挥发性成分数量（见表1）由表1可知，从4个香茅精油样品中共检出85个挥发性成分。2016年刈割后马上提取的精油检出35个成分，贮存于内塞瓶3 a后检出41个成分，6 a后检出45个成分，贮存于滴管瓶6 a后检出43个成分；贮存6 a后的精油总峰面积显著低于贮存3 a和提取当年（P0.05），滴管瓶贮存6 a后的精油总峰面积显著低于内塞瓶贮存6 a的精油总峰面积（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.017.T001表1不同贮存时间和容器下柠檬香茅精油峰面积和挥发性成分数量（1%）项目提取当年3 a（内塞瓶）6 a（内塞瓶）6 a（滴管瓶）总峰面积/10768.28±2.30a68.53±3.66a40.53±2.25b16.28±2.93c成分数量35414543注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。研究表明，在同一贮存容器中，随着时间延长，挥发性成分数量呈渐进性增加。总峰面积能够反映精油各挥发性组分含量之和，值越大表明各组分含量之和越大，即总气体物质浓度越高。贮存时间至6 a时，两种精油瓶中的挥发性成分均损失明显，且以滴管瓶损失更严重。2.2不同贮存时间和容器条件下柠檬香茅精油挥发性成分组成（见表2）由表2可知，将香茅精油挥发性物质分为萜类和非萜类，萜类为香茅4个精油样品的主要成分。内塞瓶贮存0~6 a的样品萜类物质的含量高达82%以上，随着贮存时间延长，萜类物质含量明显下降，提取当年的精油萜类含量为90.37%，3 a后降至86.91%，6 a后降至82.95%，而非萜类物质含量随贮存时间明显提高；滴管瓶贮存6 a后萜类含量降至57.49%，非萜类物质含量提高至38.57%。表明贮存时间的长短与贮存容器的不同对精油贮存过程中挥发性成分组成影响较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.017.T002表2不同贮存时间和容器下香茅精油挥发性成分组成类别项目提取当年3 a（内塞瓶）6 a（内塞瓶）6 a（滴管瓶）成分个数相对含量/%成分个数相对含量/%成分个数相对含量/%成分个数相对含量/%萜类萜类总和2190.37±0.17a2286.91±0.29b2182.95±0.92c2557.49±0.14d单萜烯31.38±0.06b44.12±0.25a31.46±0.07b41.36±0.06b倍半萜烯31.69±0.01b31.63±0.01c30.93±0.03d32.13±0.02a单萜醛978.78±0.07a973.01±0.48b869.78±1.18c434.03±0.11d单萜醇58.27±0.18c58.01±0.09c610.69±0.20b818.17±0.12a倍半萜醇10.25±0.02b10.13±0.02c——40.58±0.06a单萜酮——————10.49±0.02单萜酸————10.08±0.03b10.72±0.04a非萜类非萜类总和148.16±0.16d1911.90±0.25c2416.61±0.87b1838.57±0.17a烷烃20.16±0.01c40.60±0.04b83.18±0.21a10.72±0.01b烯烃——10.14±0.00c30.92±0.24b22.72±0.07a酯12.79±0.15d44.72±0.25c35.41±.010b833.45±0.17a醛30.54±0.01b20.87±0.06a20.28±0.02c10.11±0.01d酮33.57±0.23c24.85±0.35b45.86±0.47a20.77±0.01d醇20.82±0.05a10.05±0.01c10.10±0.01c20.36±0.03b呋喃20.21±0.01d20.48±0.03b10.57±0.03a10.35±0.01c其他10.08±0.01c30.19±0.01b20.30±0.01a10.08±0.02c注：“—”表示未检出；下表同。萜类包括萜烯及其含氧衍生物、萜烯包括单萜烯和倍半萜烯，萜烯含氧衍生物包括单萜含氧衍生物（单萜醇、单萜醛、单萜酮等）和倍半萜含氧衍生物（倍半萜醇、倍半萜醛、倍半萜酮等）。由表2可知，4个精油样品中的萜类均以单萜醛含量最高，含量随贮存时间显著减低，提取当年精油的单萜醛含量达78.78%，内塞瓶贮存6 a后含量为69.78%，滴管瓶贮存6 a后含量为34.03%。单萜醇含量在4个精油样品中排名第二，贮存时间至6 a时，两种精油瓶中单萜醇含量均显著高于贮存3 a和提取当年（P0.05），滴管瓶显著高于内塞瓶（P0.05）。非萜类中的各物质含量随时间变化较大，提取当年的主要物质为酯类和酮类，在内塞瓶中，两者含量随贮存时间明显增加；在滴管瓶中，贮存6 a后酯类含量增加至33.45%，但酮类下降至0.77%。2.3不同贮存时间和容器下柠檬香茅精油主要挥发性成分（见表3）4个精油样品含量大于1%的挥发性成分共有17个，各样品中含量大于1%的挥发性成分数量在8~11个。由表3可知，内塞瓶贮存0~6 a的样品最主要成分均为（E）-柠檬醛和（Z）-柠檬醛，（E）-柠檬醛含量为37.06%~39.02%，（Z）-柠檬醛含量为30.64%~33.68%，随贮存时间渐进减少；与提取当年相比，滴管瓶贮存6 a后（E）-柠檬醛和（Z）-柠檬醛含量降低，分别为18.26%、14.96%，而乙酸香叶酯含量大幅增加，为26.54%。除个别成分外，在同一容器中大多物质含量随贮存时间呈规律性变化，如甲基庚烯酮、4-壬酮、芳樟醇、乙酸香叶酯等物质含量随贮存时间延长而增加，而异柠檬醛、（Z）-柠檬醛、（E）-柠檬醛、石竹烯等物质含量随贮存时间延长而减少。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.017.T003表3不同存放时间和容器下香茅精油的主要挥发性成分及相对含量（1%）序号项目保留时间/min相对含量/%提取当年3 a（内塞瓶）6 a（内塞瓶）6 a（滴管瓶）1(1R)-(+)-反式蒎烷4.741—0.20±0.01b1.17±0.07a—24,4-二甲基-2-丁烯-4-内酯8.712———1.05±0.023甲基庚烯酮10.1372.63±0.16c3.66±0.26b4.27±0.26a0.26±0.02d42,3-二氢-1,8-桉叶素10.288——2.61±0.15a2.73±0.10a5(3E,5E)-2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯10.818——0.14±0.03b2.43±0.08a6β-罗勒烯11.9540.93±0.04b3.72±0.22a1.05±0.06b—7(Z)-氧化芳樟醇13.041———1.25±0.0584-壬酮13.1280.88±0.07b1.19±0.09a1.40±0.09a—9芳樟醇14.0641.29±0.09c1.30±0.08c1.51±0.04b3.55±0.10a10异柠檬醛16.5724.14±0.26a1.61±0.10b0.40±0.01c0.65±0.03c11Z-柠檬醛18.39733.68±0.14a31.32±0.38b30.64±0.51c14.96±0.11d12香叶醇18.7295.59±0.26ab5.83±0.17a5.72±0.02ab5.43±0.12b13E-柠檬醛19.28539.02±0.39a38.44±0.89a37.06±0.71b18.26±0.10c14甲酸香叶酯19.990—0.20±0.01c0.52±0.02b3.89±0.05a15乙酸香叶酯22.1702.79±0.15d4.40±0.24c4.84±0.23b26.54±0.15a16β-石竹烯23.3001.28±0.02a1.25±0.01b0.51±0.02c—17α-香柠檬烯23.6350.22±0.01c0.21±0.00c0.37±0.01b1.43±0.03a注：“—”表示无此数据；下表同。2.4不同贮存时间和容器下柠檬香茅精油相似性（见表4、表5）由表4可知，同一容器中精油随着贮存时间延长，共有的成分逐渐减少，贮存3 a后与提取当年的样品中仍有29个相同成分，贮存6 a后与提取当年仅18个共有成分。滴管瓶（6 a）与内塞瓶（6 a）的共有成分较多，共21个；与内塞瓶其余2个样品共有成分较少，仅10~12个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.017.T004表4不同存放时间和容器下香茅精油共有的挥发性成分个数项目提取当年3 a（内塞瓶）6 a（内塞瓶）6 a（滴管瓶）提取当年352918103 a（内塞瓶）—4126126 a（内塞瓶）——45216 a（滴管瓶）———43由表5可知，同一贮存容器中不同贮存时间的精油样品相似率较高，在0.989~0.996之间，不同贮存容器样品之间的相似率较低，在0.697~0.723之间。研究表明，内塞茶色瓶更有助于保持精油的稳定性，贮存容器对精油品质的影响更大，贮存时间的影响相对较小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.017.T005表5不同存放时间和容器下香茅精油挥发性成分相似率项目提取当年3 a（内塞瓶）6 a（内塞瓶）6 a（滴管瓶）提取当年1.0000.9960.9900.6973 a（内塞瓶）—1.0000.9890.7236 a（内塞瓶）——1.0000.7206 a（滴管瓶）———1.0003讨论植物精油的品质除了取决于植物品种、栽培环境和提取工艺外，植物和精油贮存过程中的贮存条件对植物精油中化学成分的组成影响较大，进而影响精油品质。目前关于贮存条件对精油挥发性成分影响的研究报道多集中于植物的贮存条件。张笮晦等[15]发现，肉桂叶在不同贮存温度（15、20、25、30 ℃、室温）、不同贮存时间（0~90 d）条件下，提取的精油微量萜类成分的种类和含量均存在较大差异，贮存80 d以上的肉桂叶中基本不含萜类成分。蒋志惠等[16]提取了贮存0~2年的北艾和蕲艾精油，发现随着贮存时间增加，艾叶精油的提取率下降，贮存年份主要影响萜类和酯类的含量比例，萜类占比随着贮存年份的增加而降低。Kazaz等[17]研究发现，玫瑰花瓣在0~28 d的贮存过程中，精油提取率显著下降，贮存（7~28 d）花瓣提取的精油中，香茅醇、十六烷、十九烷、二十烷、甲基丁香酚含量明显高于新鲜花瓣提取的精油，而橙花醇和香叶醇含量明显低于新鲜精油，表明植物体贮存条件能够影响精油成分，萜类物质在贮存过程中更易损失，与本试验研究结果一致。这可能与某些萜类物质沸点较低、更易挥发或更易氧化等因素有关。Mockutë等[18]研究发现，益母草贮存0~40个月的过程中，单萜烯、倍半萜烯等低沸点的化合物易挥发损失，如α-蒎烯、β-波旁烯、β-石竹烯、α-葎草烯、大根香叶烯D等；干草贮存40个月后提取的精油中，上述萜烯类物质大大减少，且以高沸点化合物为主。商业化种植的益母草精油主要成分为叶绿醇，野生益母草为氧化石竹烯。新鲜干益母草提取的精油贮存7个月后，β-石竹烯和α-葎草烯含量明显减少，而氧化石竹烯和氧化葎草烯含量明显增加，且新鲜精油中的β-石竹烯+氧化石竹烯、α-葎草烯+氧化葎草烯的总量与贮存7个月后的精油相当，表明精油贮存过程中β-石竹烯和α-葎草烯发生了氧化反应。本研究发现，贮存过程中，精油中的β-石竹烯和α-葎草烯逐渐减少，但未发现其氧化物逐渐增加，可能本试验贮存环境更利于这两种物质挥发，而不利于发生氧化反应，或更利于转化生成其他物质。Rowshan等[19]发现，百里香在室温下贮存3个月后，百里酚和香芹酚的前体物质如α-蒎烯、α-松油烯、月桂烯等低沸点物质明显减少，而百里酚和香芹酚的含量分别提高了26.6%和23.0%。Misharina[20]研究表明，光照会显著影响芫荽种子精油中的某些物质（如单萜）的转化。因此，香茅精油挥发性物质随着时间消长应该主要与化学物质本身的特性，如沸点、氧化还原性质等有关，还与贮存环境条件，如贮存温度、光照、时间、瓶子密封性等有关。本研究中，滴管瓶与内塞瓶精油挥发性成分差异大，原因可能是滴管瓶密封性较差，利于低沸点物质的挥发和氧化。4结论本试验中，在0~6 a的贮存过程中，香茅精油中挥发性物质总浓度降低、成分数量增加。内塞瓶香茅精油中的主要组分（萜类、单萜醛、（E）-柠檬醛和（Z）-柠檬醛）含量随着贮存时间延长而逐渐下降，非萜类（酯类、酮类等）含量明显增加，但贮存6 a后仍以（E）-柠檬醛（37.06%）和（Z）-柠檬醛）（30.64%）含量最高；滴管瓶香茅精油中萜类、单萜醛、（E）-柠檬醛和（Z）-柠檬醛含量大幅减少，酯类含量大幅增加，精油以乙酸香叶酯含量最高，达26.54%。结果表明，贮存时间和容器对精油的挥发性物质组成均具有影响，但贮存容器对精油稳定性的影响更大。