近年来，随着我国畜牧业结构调整，紫花苜蓿的种植和加工受到重视[1]。但紫花苜蓿具有蛋白质和水分含量高、可溶性碳水化合物及糖含量低的特性，导致紫花苜蓿单独青贮存在易腐烂变质的问题[2]。研究表明，添加乳酸菌制剂能够改善紫花苜蓿的青贮发酵品质和营养品质[3-5]。但有研究发现，受区域性环境因素的影响，接种乳酸菌可能对紫花苜蓿青贮品质无明显影响，可能是更能够适应环境的附着微生物更具竞争力，从而主导青贮过程[6]。添加适应当地气候条件的乳酸菌菌株能够提升青贮品质[7]。本课题组前期以自然发酵60 d的全株玉米、紫花苜蓿、鸭茅青贮饲料为试验材料，从中筛选出3种优质乳酸菌（植物乳杆菌、戊糖片球菌和短乳杆菌）并将其制成菌液。本研究旨在研究上述3种优质乳酸菌菌液对紫花苜蓿青贮品质的提升效果，为昆明地区青贮用乳酸菌制剂的研发提供参考。1材料与方法1.1试验材料植物乳杆菌、短乳杆菌和戊糖片球菌由云南农业大学云贵高原草地资源与利用重点实验室筛选获得，其活菌数分别为7.62×1011、7.36×1011及8.78×1011 CFU/mL。WL525紫花苜蓿由云南农业大学后山基地种植。1.2试验设计试验设6个处理，分别为自然发酵组（CK组，对照组）、单独添加5 mL/kg植物乳杆菌组（Z组）、单独添加5 mL/kg戊糖片球菌组（W组）、单独添加5 mL/kg短乳杆菌组（D组）、植物乳杆菌与短乳杆菌按1∶1配合添加组（Z1D1组）、戊糖片球菌和短乳杆菌按1∶1配合添加组（W1D1组），每个处理3个重复。1.3苜蓿青贮制备2021年10月15日，将现蕾期紫花苜蓿刈割，刈割后使用铡草机切碎至3~4 cm，混匀，晾晒至萎篶（含水量为61%），按试验设计将乳酸菌菌液单独或按1∶1配比添加到紫花苜蓿原料中，添加时将菌液均匀喷洒在原料表面（CK组喷洒等量蒸馏水），充分混匀，揉搓，确保喷洒均匀。将处理好的样品装入容积为5 kg的聚乙烯塑料桶，每处理装3桶，即为3次重复，压实，密封，自然发酵60 d，发酵结束后开封取样，测定相关指标。1.4测定指标及方法1.4.1感官评定按照德国农业协会评分标准，根据青贮的气味、色泽和质地，参考文献[8]将青贮饲料划分为腐败（4级）、中等（3级）、尚好（2级）和优良（1级）4个等级并赋予分值。1.4.2微生物数量采用稀释涂布平板法[9]进行乳酸菌、酵母菌、霉菌和好氧细菌计数，乳酸菌采用MRS培养基，好氧细菌使用营养琼脂培养基，酵母菌和霉菌采用孟加拉红（虎红）培养基培养。乳酸菌和好氧细菌在30 ℃下培养2 d；酵母菌和霉菌在28 ℃条件下培养3~5 d，培养结束后进行平板菌落计数。1.4.3发酵品质pH值采用pH计测定，有机酸（乳酸、乙酸、丁酸及丙酸）含量采用高效液相色谱法测定[10]，色谱柱为Roa-organic Acid H＋（8%），柱温为30 ℃，进样量20 μL，检测波长为210 nm，流速为0.6 mL/min。氨态氮（NH3-N）采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[11]。1.4.4常规营养成分参照张丽英[12]的《饲料分析及饲料质量检测技术》测定青贮样品粗蛋白（CP）、可溶性碳水化合物（WSC）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、粗灰分（Ash）含量。1.5数据统计与分析采用SPSS 23.0统计分析软件进行单因素方差分析，Duncan's法多重比较。采用模糊数学隶属函数法[13]对青贮品质进行综合评价。若测定指标与青贮品质呈正相关，按公式（1）计算其隶属函数值。R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)(1)若测定指标与青贮品质呈负相关，按公式（2）计算其隶属函数值。R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)(2)式中：R(Xi)为某一指标隶属函数值；Xi为该指标的测定值；Xmax和Xmin分别为该指标所有测定值中的最大值和最小值。对所有指标隶属函数值进行相加，求其平均值，以平均值大小进行排名。平均值越大，青贮品质越优。2结果与分析2.1乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料感官评价等级的影响（见表1）由表1可知，与CK组相比，添加乳酸菌菌液提高了紫花苜蓿青贮样品的颜色和气味。CK组获得的紫花苜蓿青贮样品，其评价等级为3级中等，得分为9分。添加乳酸菌青贮的紫花苜蓿样品，评价等级为2级尚好，得分为12~14分。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.024.T001表1乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料感官评价等级的影响组别气味及得分质地及得分色泽及得分等级及得分CK组丁酸味（6）茎叶结构保持完整、松散柔软（2）淡黄色（1）3级（9）Z组芳香味（11）茎叶结构保持完整、松散柔软（2）黄褐色（1）2级（14）W组芳香味（11）茎叶结构保持完整、松散柔软（2）黄褐色（1）2级（14）D组酸香味（9）茎叶结构保持完整、松散柔软（2）黄褐色（1）2级（12）Z1D1组微弱酸香味（10）茎叶结构保持完整、松散柔软（2）黄褐色（1）2级（13）W1D1组芳香味（11）茎叶结构保持完整、松散柔软（2）黄褐色（1）2级（14）2.2乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料微生物数量的影响（见表2）由表2可知，与CK组相比，Z组、W组、Z1D1组、W1D1组紫花苜蓿青贮饲料的乳酸菌数量均显著提高（P0.05），且W组乳酸菌数量最多，显著高于其他组（P0.05）。与CK组相比，W组、Z1D1组、W1D1组紫花苜蓿青贮的好氧细菌数量显著降低（P0.05），以W1D1组效果最好。与CK组相比，以D组、W1D1组、Z1D1组紫花苜蓿青贮的霉菌数量最少，表明添加异型（D组）或同型异型复合乳酸菌菌液（Z1D1组、W1D1组）能够显著抑制霉菌等有害真菌的生长繁殖，各处理均未检测出酵母菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.024.T002表2乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料微生物数量的影响组别乳酸菌好氧细菌霉菌酵母菌CK组7.32±0.00e5.92±0.01a2.23±0.05aNDZ组7.37±0.01d5.74±0.04a1.68±0.06bNDW组9.09±0.02a4.50±0.02c1.38±0.07cNDD组7.33±0.01e5.16±0.02b1.15±0.04eNDZ1D1组7.48±0.01c4.57±0.09c1.29±0.02dNDW1D1组7.75±0.02b3.79±0.18d1.18±0.01eND注：1.同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.ND表示未检测到该指标数据；下表同。lgCFU/g2.3乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料发酵品质的影响（见表3）由表3可知，CK组紫花苜蓿青贮饲料的pH值为5.23。与CK组相比，各试验组紫花苜蓿青贮饲料的pH值显著降低（P0.05）。与CK组相比，各试验组紫花苜蓿青贮饲料NH3-N含量显著降低（P0.05），表明添加优质本土乳酸菌菌液能够有效抑制有害菌对饲料原料中蛋白质和氨基酸的分解，有效保存青贮饲料的营养物质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.024.T003表3优质本土乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料发酵品质的影响组别pH值NH3-N乳酸乙酸丙酸丁酸CK组5.23±0.01a2.42±0.00a26.43±0.06f42.47±0.03c0.45±0.00a0.44±0.00eZ组4.91±0.01b1.78±0.01d33.87±0.25d44.10±0.26b0.28±0.01cNDW组4.84±0.02c1.75±0.00e27.09±0.04e42.17±0.19c0.24±0.00dNDD组4.91±0.01b1.70±0.01f39.36±0.18a44.42±0.31b0.24±0.00dNDZ1D1组4.90±0.02b1.83±0.00b37.15±0.01c40.39±0.03d0.21±0.00eNDW1D1组4.87±0.01c1.80±0.00c38.48±0.05b46.16±0.03a0.32±0.01bNDg/kg与CK组相比，各试验组紫花苜蓿青贮饲料乳酸含量显著增加（P0.05），W1D1组苜蓿青贮饲料乳酸含量最高；W1D1组、D组、Z组紫花苜蓿青贮样品乙酸含量显著增加（P0.05）。各组紫花苜蓿青贮样品丙酸含量排序为：CK组W1D1组Z组D组=W组Z1D1组。添加优质本土乳酸菌菌液调制的青贮饲料均未检测处BA，表明添加优质本土乳酸菌菌液抑制了厌氧细菌梭菌产生[14]，可能是自然发酵下有害细菌梭菌有一定的繁殖能力，从而产生了少量丁酸。2.4乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料营养成分的影响（见表4）由表4可知，与CK组相比，各试验组紫花苜蓿青贮饲料的CP含量显著增加（P0.05），NDF含量显著降低（P0.05），D组紫花苜蓿青贮饲料的CP含量最高，NDF含量最低。Z1D1组、D组、Z组紫花苜蓿青贮饲料的ADF含量显著低于CK组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.024.T004表4乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料营养成分的影响组别CPWSCNDFADFEECK组13.33±0.06d9.81±0.18a55.89±0.04a40.16±0.14b20.58±0.27bcZ组14.35±0.29b9.22±0.08a53.35±2.11b38.60±0.36c21.15±0.24abW组15.30±0.28a9.72±0.05a50.10±1.03c40.84±0.07ab19.87±0.29cD组15.33±0.06a9.01±0.05a41.83±0.54e38.32±0.20c22.19±0.67aZ1D1组13.49±0.18c9.68±0.06a43.09±0.57e37.20±0.05d18.70±0.42dW1D1组15.21±0.03a9.09±0.41a45.95±0.23d41.19±0.20a18.67±0.32d%DM2.5不同处理紫花苜蓿青贮品质的综合评价结果（见图1）由图1可知，不同处理紫花苜蓿青贮饲料综合品质排序为D组W组Z1D1组W1D1组Z组CK组。与CK组相比，各试验组紫花苜蓿的青贮品质明显提高，以D组的综合评分最高，生产中可优先选用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.01.024.F001图1不同处理紫花苜蓿青贮品质综合评价结果3讨论3.1优质本土乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料微生物数量的影响青贮饲料中微生物的种类和数量直接影响青贮发酵品质，其中乳酸菌是青贮发酵的关键微生物。乳酸菌数量高于105 CFU/g时，乳酸菌在青贮过程中才能够建立优势菌群，降低pH值，可以有效抑制有害微生物的活动[15]。本试验中，与CK组相比，添加优质本土乳酸菌菌液显著增加了紫花苜蓿青贮饲料的乳酸菌数量，表明添加优质本土乳酸菌有效促进了乳酸菌的繁殖。酵母菌、霉菌、好氧细菌是青贮中的有害菌，有害菌的存在会引起青贮饲料营养物质的消耗[16]。本试验中，优质本土乳酸菌添加组好氧细菌和霉菌显著低于CK组，表明添加优质本土乳酸菌菌液在抑制好氧细菌和霉菌滋生方面发挥了较好的效果。3.2优质本土乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料发酵品质的影响紫花苜蓿因碳水化合物含量低，缓冲能值高，不易青贮成功[17]。在实践生产中，紫花苜蓿青贮一般会添加糖制剂、乳酸菌制剂或其他化学添加剂等提高青贮发酵品质。青贮发酵的pH值、NH3-N和有机酸等含量可以衡量青贮发酵品质[18]。本试验结果表明，与CK组相比，添加优质本土乳酸菌显著降低了紫花苜蓿青贮饲料的pH值和NH3-N含量，提高其乳酸、乙酸含量，表明添加优质本土乳酸菌菌液促进了紫花苜蓿青贮发酵过程中有机酸的生成和营养物质保存。3.3优质本土乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料营养品质的影响青贮饲料的营养成分是评定青贮质量的重要指标。青贮饲料的发酵品质越好，保存的营养成分越多，表明营养物质的损失越少[19-20]。杨秀梅等[19]研究不同添加剂对高寒地区紫花苜蓿青贮品质的影响，发现乳酸菌制剂处理组CP含量显著高于其他处理组。张志飞等[3]研究发现，添加混合乳酸菌制剂制作的紫花苜蓿裹包青贮料CP含量增加，pH值降低，乳酸菌数量增加与本研究的结果一致。原因可能是添加乳酸菌制剂后，青贮环境中的乳酸菌基数增大，乳酸菌大量繁殖，降低pH值，进而抑制蛋白酶的活性，减少CP降解。4结论本试验结果显示，与自然发酵相比，添加优质本土乳酸菌可显著提高紫花苜蓿青贮样品的乳酸菌数量，降低好氧细菌和霉菌的数量，提高青贮样品乳酸和乙酸含量，进而有效抑制有害菌对饲料原料中蛋白质和氨基酸的分解，保存青贮饲料的营养物质。不同处理紫花苜蓿青贮饲料综合品质排序为D组W组Z1D1组W1D1组Z组CK组。