玉米作为我国重要的饲用作物，年产量高[1]。但玉米皮中纤维素和半纤维素含量较高，难以被畜禽消化利用，导致营养损失严重[2]。阿魏酸的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是一种酚酸，在自然界中广泛存在，属于桂皮酸衍生物[3]。阿魏酸在植物细胞壁中可以连接半纤维素与半纤维素、半纤维素与木质素、木质素与木质素[4]。阿魏酸主要以单体和二聚体形式通过酯键与阿拉伯木聚糖残基相连，形成阿魏酸酯键[5]，使植物细胞壁的空间网状结构更加坚固，导致外源消化酶难以与半纤维素以及纤维素结合发挥作用，饲料难以被消化利用[6-7]。阿魏酸酯酶是羧酸酯酶的一个亚类，能够水解植物细胞壁中阿魏酸与阿拉伯糖、半乳糖等多糖之间形成的酯键，释放出阿魏酸单体或二聚体[8-9]。阿魏酸酯酶在水解阿魏酸酯键后，植物细胞壁中半纤维素与半纤维素、半纤维素与木质素以及木质素与木质素之间的交联将直接断裂，阿魏酸从中游离而出，细胞壁空间结构因被破坏而变得疏松，更易与纤维素酶发生结合，提高纤维素降解率[10-11]。目前，关于阿魏酸酯酶的应用研究还不够充分，尤其是饲料领域的相关研究更少。因此，本研究拟筛选高产阿魏酸酯酶菌株，旨在将阿魏酸酯酶应用于饲料发酵行业，从而提高纤维素降解率，为优质饲料的生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料玉米皮由河北农业大学二分场提供。菌株由本实验室分离保存。NA培养基购自北京谨明生物科技有限公司，PDA培养基购自上海泽叶生物科技有限公司，MRS固体培养基购自北京索莱宝科技有限公司。1.2测定指标及方法1.2.1菌株筛选将本实验室保存菌株于筛选固体培养基十字划线，放入37 ℃培养箱倒置培养24 h，观察划线周围是否有透明圈出现。将有透明圈的菌株进行划线纯化，并将纯化后的单菌落接种至种子培养基，37 ℃摇床180 r/min培养12 h。按6%的接种量接种至发酵培养基，37 ℃摇床180 r/min培养24 h。将发酵液5 000 r/min离心5 min，取100 μL上清液，加入筛选固体培养基的牛津杯中，放入37 ℃培养箱正置培养24 h，观察透明圈大小，测定透明圈较大菌株的阿魏酸酯酶活力。1.2.2阿魏酸酯酶活力测定精确称取0.100 0 g反式阿魏酸置于1.5 mL乙醇中，定容至100 mL，即为反式阿魏酸标准溶液，分别取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL反式阿魏酸标准溶液使用乙醇定容至100 mL，得到5、7、9、11、13 mg/L的反式阿魏酸标准溶液。在320 nm波长下，以乙醇为空白测定溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，以反式阿魏酸质量浓度为横坐标制作标准曲线，计算线性回归方程。酶活力定义：在反应条件下，每分钟降解底物生成1 μmoL阿魏酸所需要的酶量为一个酶活力单位。将待测样品4 000 r/min离心10 min，取5 mL稀释2倍的上清液加入装有5 mL柠檬酸缓冲溶液的试管中，55 ℃水浴5 min。加入去淀粉麦麸0.33 g，40 ℃反应15 min，沸水浴5 min终止反应。反应液4 000 r/min离心10 min，将上清液稀释1倍，取1 mL加入4 mL乙醇中，4 000 r/min离心10 min，在320 nm波长下测定样品吸光值，并结合线性回归方程计算样品阿魏酸酯酶活力。1.2.3菌种鉴定制备目标菌株的NA培养基平板与革兰氏染色涂片，进行形态学鉴定。对目标菌株16S rDNA序列进行测序，将测序结果于NCBI数据库进行Blast同源性比较，构建系统发育树进行分子生物学鉴定，参照《伯杰氏系统细菌学手册》[12]与《常见细菌系统鉴定手册》[13]对菌株进行生理生化试验。1.3玉米皮发酵试验将玉米皮使用蒸馏水复水，得到干物质含量约为500 g/kg鲜重（FW）的物料，在500 mL密封塑料瓶中压实发酵。设置4个处理组，对照组（C组）玉米皮添加等量蒸馏水发酵，T1组玉米皮添加2 U/g FW纤维素酶发酵，T2组玉米皮添加5×106 CFU/g FW的筛选菌株发酵，T3添加2 U/g FW的纤维素酶与5×106 CFU/g FW筛选菌株发酵，每组5个重复，室温发酵15 d。1.3.1样品采集采用五点取样法取10 g发酵玉米皮加入装有玻璃珠的100 mL无菌水中，静置20 min，置于180 r/min摇床20 min，获得待测样品。1.3.2营养指标测定待测样品稀释102~106倍，分别于NA、PDA、MRS固体培养基（PDA培养基需加入土霉素）涂布。NA、MRS平板于37 ℃培养箱倒置培养，PDA平板于28 ℃培养箱倒置培养，待长出菌落计算有效活菌数。使用电子pH计测定玉米皮发酵1、3、6、10、15 d的pH值。参照范氏法[14-15]采集并测定样品中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素含量，计算降解率。降解率=(c1-c2)/c1×100%（1）式中：c1为发酵前含量（%）；c2为发酵后含量（%）。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 24的方差分析程序进行分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1菌株阿魏酸酯酶活力测定结果（见表1）从实验室保存的228株菌中筛选得到12株具有阿魏酸酯酶生产能力的菌株。由表1可知，菌株A30产酶能力明显高于其他菌株，酶活力为177.1 U/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.014.T001表1菌株阿魏酸酯酶活力测定结果菌株编号酶活力菌株编号酶活力3A3-15108.50±0.25F17137.20±0.24B-1d112.60±0.25JHKL141.70±0.23JH78.80±0.22110650.80±0.21Z-1456.10±0.24A2067.90±0.20A30177.10±0.22A15100.40±0.24N5-2138.70±0.25A1478.20±0.22U/L2.2菌种鉴定结果2.2.1形态学鉴定结果（见图1）由图1可知，菌株A30的菌落为圆形、淡黄色、不透明、表面粗糙、有隆起、边缘不规则。菌体呈杆状、两端钝圆，革兰氏染色结果为阳性，具有解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的形态特征。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.014.F001图1菌落与菌体形态2.2.2分子生物学鉴定结果菌株A30的16S rDNA序列含1 416个碱基，利用NCBI数据库进行BLAST比对，发现其与多种芽孢杆菌属菌株同源性达99%以上。通过MEGA-X软件的Neighbor-Joining分析方法构建菌株A30的系统发育树，见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.014.F002图2菌株A30系统发育树由图2可知，该菌株与解淀粉芽孢杆菌亲缘关系最近，初步判断菌株A30为解淀粉芽孢杆菌。2.2.3菌株A30的生理生化特征结果（见表2）由表2可知，菌株A30生理生化特征符合解淀粉芽孢杆菌生理生化特征。结合形态学以及分子生物学鉴定结果，确定菌株A30为解淀粉芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.014.T002表2菌株A30的生理生化特征结果项目结果项目结果革兰氏染色+V-P反应+芽孢染色+明胶液化+接触酶反应+硫化氢试验-氧化酶反应-硝酸盐还原+淀粉水解+注：“+”为阳性反应；“-”为阴性反应。2.3玉米皮发酵试验结果2.3.1发酵前后玉米皮的有效活菌数（见表3）由表3可知，玉米皮发酵后芽孢杆菌数明显升高，T2组、T3组玉米皮发酵的芽孢杆菌数均有较高活菌数，可能是菌株A30利用物料中的营养物质生长繁殖。玉米皮发酵后乳酸菌数明显上升，可能是因为玉米皮附着的乳酸菌在厌氧环境下大量繁殖。玉米皮发酵后霉菌数明显降低，可能是发酵初期细菌消耗了大量残留空气，乳酸菌繁殖产酸导致环境pH值降低，抑制了霉菌生长。研究表明，菌株A30能够提高发酵玉米皮芽孢杆菌活菌数，对乳酸菌和霉菌活菌数无影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.014.T003表3发酵前后玉米皮的有效活菌数项目组别发酵前含量发酵后含量芽孢杆菌数C组（对照组）7.34±0.02a8.13±0.02bT1组7.30±0.01a8.09±0.03bT2组7.34±0.02a8.27±0.02aT3组7.47±0.02a8.28±0.02a乳酸菌数C组（对照组）4.90±0.01a8.47±0.01aT1组4.93±0.01a8.42±0.03aT2组4.96±0.01a8.40±0.02aT3组4.97±0.01a8.52±0.03a霉菌数C组（对照组）5.75±0.01a4.38±0.01aT1组5.71±0.01a4.33±0.01aT2组5.72±0.01a4.42±0.01aT3组5.68±0.01a4.41±0.01a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。lgCFU/g2.3.2发酵时间对发酵后玉米皮的pH值的影响（见图3）由图3可知，发酵1 d后，所有处理组发酵玉米皮的pH值均迅速降至5以下；之后保持在pH值在4.3以下，可能是玉米皮附着的乳酸菌在无氧环境下大量繁殖同时产酸造成，表明菌株A30对玉米皮发酵pH值无影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.014.F003图3发酵时间对发酵后玉米皮的pH值的影响2.3.3发酵对玉米皮纤维指标的影响（见表4）由表4可知，与其他处理组相比，发酵后T3组各指标含量均最低，T3组对中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素的降解率均最高，T1组次之，对照组降解率最低。可能是因为T3组同时添加菌株A30和纤维素酶，菌株A30生长代谢产生阿魏酸酯酶，阿魏酸酯酶水解玉米皮细胞壁中的阿魏酸酯键，断开了多糖间的网状交联，破坏了细胞壁空间结构，使纤维素暴露在外。纤维素酶从而更容易与纤维素相结合并发挥作用，将其分解为单糖。因此，T3组比单独添加纤维素酶的T1组降解率高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.014.T004表4发酵对玉米皮纤维指标的影响项目组别发酵前含量发酵后含量降解率中性洗涤纤维C组（对照组）24.28±0.1223.38±0.11a3.70±0.02dT1组24.41±0.1719.96±0.12c18.23±0.07bT2组24.20±0.1221.50±0.15b11.16±0.04cT3组24.38±0.1418.54±0.14d23.96±0.07a酸性洗涤纤维C组（对照组）11.25±0.1010.86±0.07a3.44±0.02dT1组11.62±0.119.36±0.07c19.43±0.09bT2组11.24±0.0710.08±0.08b10.37±0.05cT3组11.76±0.089.00±0.05d23.47±0.08a半纤维素C组（对照组）13.03±0.1112.52±0.09a3.91±0.02dT1组12.79±0.1410.60±0.10c17.15±0.08bT2组12.96±0.1011.42±0.12b11.85±0.05cT3组12.62±0.119.54±0.10d24.41±0.08a纤维素C组（对照组）8.76±0.068.50±0.05a2.96±0.02dT1组9.22±0.066.75±0.06c26.77±0.07bT2组8.93±0.077.86±0.06b11.98±0.04cT3组9.16±0.066.39±0.05d30.21±0.09a%3讨论我国畜牧养殖业迅速发展[16]，而畜牧养殖业的发展离不开优良粗饲料的供应，但饲料中粗纤维含量高，导致家畜消化利用率低，是制约畜牧业发展的因素之一[17-18]。目前，常使用添加纤维素酶降解饲料中的木质纤维素，但效果不太理想，后续研究发现阿魏酸酯酶可以提高纤维素降解率。1991年首次得到纯化的阿魏酸酯酶[19]，后续逐渐发现各种来源的阿魏酸酯酶，且大多是霉菌中发现，曲霉属丝状真菌能够占据所有产阿魏酸酯酶微生物的1/3[20]。但由于安全性问题，无法将其应用在饲料发酵中。本研究筛选到的是一株解淀粉芽孢杆菌，根据我国农业农村部发布的《饲料添加剂品种目录》，可以作为添加剂进行饲料发酵。且比Donaghy等[21]、李丽等[22]、胡博涵等[23]筛选出的产阿魏酸酯酶菌株具有更高的阿魏酸酯酶活力。本试验发现，单独使用菌株A30能够降低玉米皮的半纤维素和纤维素含量，使用菌株A30和纤维素酶协同处理能够大幅提高发酵玉米皮中半纤维素和纤维素的降解率，这是由于菌株A30代谢产生的阿魏酸酯酶破坏了植物细胞壁的空间结构，使其中的结构性碳水化合物更多地被纤维素酶结合并水解[24]。Li等[25]利用前期筛选得到的产阿魏酸酯酶植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）A1进行玉米秸秆发酵，结果发现，与相比单独添加菌株A1或单独添加纤维素酶相比，二者协同处理对玉米秸秆纤维素降解率的提升幅度更大，Li等[26]在狼尾草青贮中验证了这一结论。Xu等[27]利用产阿魏酸酯酶的植物乳酸杆菌进行玉米秸秆与马铃薯浆混合发酵，发现产阿魏酸酯酶菌株与纤维素酶协同处理组纤维素降解效果最佳，但单独添加产阿魏酸酯酶菌株并未对纤维素含量产生影响。李福厚[28]分别在玉米秸秆、巨菌草、苜蓿等青贮中进行了试验，结果发现，产阿魏酸酯酶菌株与纤维素酶协同处理在所有试验中的纤维素降解率均为最高，与本研究结论一致。4结论本研究筛选到一株产阿魏酸酯酶活力可达177.1 U/L的解淀粉芽孢杆菌A30，该菌株能够提高发酵玉米皮的芽孢杆菌活菌数，对发酵玉米皮的乳酸菌、霉菌活菌数、pH值无影响，与纤维素酶协同作用对中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素产生的降解效果最好。