赤羽病（AKV）是由阿卡斑病毒（AKAV）引起的以流产、早产、死胎、新生胎儿先天性关节弯曲及积水性无脑综合征为特征的一种虫媒传染病[1-2]。Wang等[3]在2006年—2015年对我国24个省级行政区的牛、羊血清进行AKV抗体检测，发现AKAV血清抗体阳性分布在23个省级行政区。吉林、内蒙古东北部等地区的养牛户发现，患病牛犊出生后站立不稳、四肢关节弯曲呈蜷缩状，脊柱和头部变形，部分患病牛犊还有吞咽困难和双目失明等症状，且死亡率较高，后确诊为赤羽病感染[4]。世界动物卫生组织（OIE）将赤羽病列为我国的二类进境动物疫病及重要的检疫疾病之一[5]。目前检测和诊断赤羽病的方法包括病原学检查、血清学诊断、分子生物学检测等，但这些检测方法不能用于田间和进境AKAV病毒阳性抗体血清的快速检测。因此，开发一种检测速度快、操作简单、敏感性高、特异性强的检测方法对赤羽病的防控和监测尤为重要。孕期母牛最易感AKAV[6]，本研究采用核衣壳N蛋白标记胶体金溶液，建立了牛AKAV胶体金抗体检测试纸条，以期为牛赤羽病的检疫初筛提供参考。1材料与方法1.1试验材料抗AKAV N蛋白的兔多克隆抗体由北京博奥森生物科技有限公司制备，兔抗牛IgG购自Sigma公司，商品化ELISA ID Screen AKAV抗体检测试剂盒购自法国IDevt公司，AKAV N蛋白由中国检验检疫科学研究院实验室制备。AKAV阳性、阴性血清为临床田间采集样品，牛病毒性腹泻、牛结核、布鲁氏菌、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病的阳性血清均由中国检验检疫科学研究院实验室血清样本库保存。氯金酸、柠檬酸三钠购自国药集团药业股份有限公司，牛血清白蛋白、酪蛋白钠盐、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、吐温20均购自美国Sigma公司；硝酸纤维素NC膜购自德国赛多利斯集团。1.2主要仪器XYZ3050TM喷金划膜仪、CM4000TM超速斩切机系统购自美国BIO DOT公司，CTD300裁条机和卷式贴膜仪购自上海金标生物科技有限公司。1.3胶体金的制备使用柠檬酸三钠还原法制备万分之四胶体金，将4 mL的1%氯金酸溶液移入100 mL双蒸水中，加热，加入6.4 mL的1%柠檬酸三钠溶液，使氯金酸溶液完全被还原成酒红色，冷却，使用双蒸水定容至100 mL。1.4AKAV N蛋白的最佳标记量采用棋盘滴定法确定蛋白的标记量和K2CO3用量。向1.5 mL EP管内加入1 mL胶体金溶液，依次向各管加入2、4、6、8、10、12 μL的0.2 mmol/L K2CO3；分别对应标记蛋白量为5、10、15、20 μg，混匀，10 min后加入0.1 mL的10% NaCl溶液，反应2 h，保持酒红色不变时所用的蛋白标记用量，即为蛋白最佳标记量和最适K2CO3用量。1.5胶体金标记蛋白取100 mL胶体金溶液至干净的烧杯内，使用优化好的条件加入600 μL的0.2 mmol/L K2CO3和1 mg AKAV N蛋白，搅拌30 min，混匀，加入5 mL的10% BSA搅拌30 min，4 ℃放置1 h，4 ℃、10 000 r/min离心30 min，弃上清，保留浓缩胶体金颗粒，使用50 mL复溶液重悬，使用1 mL铺金（长30 cm×宽7 mm），置于37 ℃温箱烘干。1.6试纸条组装使用喷金划膜仪将1.2 g/L兔抗牛IgG和0.25 g/L兔抗N蛋白多克隆抗体喷涂在NC膜上，分别作为T线和C线，37 ℃鼓风干燥箱烘干，依次按照吸水纸、NC膜、金标垫及样品垫粘贴于PVC底板上，使用CM4000TM超速斩切机系统将组装好的试纸条切割成3 mm的宽度，进行样品的测试和工艺优化。1.7测定指标及方法1.7.1试纸条灵敏度将AKAV阳性血清使用样本稀释液按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024进行梯度稀释。1.7.2试纸条特异性使用同批次试纸条检测牛病毒性腹泻病毒、牛结核、布鲁氏菌、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病和蓝舌病毒的阳性血清，验证试纸条的特异性。1.7.3田间临床样品使用同批次试纸条和商品化ELISA（ID Screen AKAV）检测40份田间临床牛血清样品。1.7.4试纸条稳定性将组装好的试纸条置于铝箔袋，密封，37 ℃恒温箱保存1个月，检测田间临床样本，评估试纸条稳定性。2结果与分析2.1最佳蛋白标记量的确定棋盘滴定法结果显示，加入10 μL的0.2 mol/L K2CO3对应的AKAV N蛋白的标记量为10 μg时，胶体金溶液颜色呈酒红色且保持不变，即为最佳蛋白标记量。2.2灵敏度检测结果（见图1）由图1可知，当AKAV的阳性血清稀释度为1∶512时，T线仍显色，而稀释度为1∶1 024时，仅质控线显色，表明该试纸条灵敏性较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.025.F001图1灵敏度检测结果注：A~J稀释度为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024。2.3特异性检测结果（见图2）由图2可知，除赤羽病血清为阳性外，其他牛病血清抗体均为阴性，表明该试纸条具有良好的特异性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.025.F002图2试纸条特异性检测注：A~H分别为赤羽病血清、阴性血清、牛病毒性腹泻病血清、牛结核血清、布鲁氏菌血清、牛巴氏杆菌病血清、地方流行性牛白血病血清、蓝舌病血清。2.4田间临床样品检测结果（见图3、表1）由图3和表1可知，ID Screen AKAV试剂盒检出阳性27份，阴性13份；试纸条检出阳性25份，阴性15份，即两种血清抗体检测方法的阳性符合率为92.6%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.025.F003图3田间临床样品检测结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.025.T001表1胶体金试纸条与ID Screen AKAV抗体检测试剂盒符合率比较结果项目试纸条阳性阴性合计ID Screen AKAV试剂盒阳性25227阴性01313合计251540符合率/%92.62.5稳定性检测结果（见图4）由图4可知，密封保存1个月的试纸条仍可检出阳性临床样本，表明试纸条稳定性好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.025.F004图4稳定性检测结果注：A~E为阳性样品，F~J为阴性样品。3讨论AKAV在我国已普遍流行[7]，牛赤羽病主要表现为新生犊牛畸形。目前尚无治疗该病的有效方法，亟须开发一种快速高效检测AKAV血清免疫学技术。N蛋白是AKAV中含量最大的核衣壳蛋白，含有3个抗原表位，是最具免疫原性的蛋白[8]，AKAV 23个分离株的N蛋白比对结果显示，毒株间氨基酸序列相似性为97%~100%，毒株间的同源性达93%~100%，表明该蛋白具有高度保守性[9]。花群义等[10]使用重组的AKAV N蛋白作为包被抗原建立了检测AKAV抗体血清的间接ELISA方法。陈冬杰等[11]采用纯化的AKAV N蛋白作为包被抗原，建立了检测牛AKAV N蛋白血清抗体的阻断ELISA方法。目前未有以AKAV N蛋白作为标记抗原，建立牛赤羽病毒胶体金抗体检测试纸条技术。胶体金免疫层析技术是由胶体金标记技术、免疫检测技术及侧向层析技术相互融合发展起来的一种新型免疫快速检测技术[12]。该技术不受检测环境影响、不需要精密仪器检测、成本低、经济环保，比较适用于现场大批量样本的检测[13]。近年来，胶体金免疫层析技术已普遍运用于动物细菌学、病毒病、寄生虫病及水生动物疫病的监测领域。江地科等[14]研制的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸与IDvet ELISA检测试剂盒阳性符合率达92.31%；严昊等[15]建立了一种现场快速检测猪流行性腹泻病毒胶体金试纸条，检测灵敏度为1×102 TCID50/mL，107份临床样本的检测结果与RT-PCR检测结果符合率为100%。孔玉方等[16]建立的布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条与诊断金标准虎红平板凝集试验检测符合率为97.4%，与IDEXX ELISA检测试剂盒的符合率为95%。目前，国内未见有AKAV N蛋白抗体检测试纸条的相关报道，但有使用试纸条检测AKAV的相关研究。杨素等[17]采用双抗体夹心免疫层析技术制备了现场检测AKAV的胶体金试纸条，但该方法检测病毒取材比较困难，检出率不高。本研究建立检测牛赤羽病病毒抗体试纸条，仅通过采血获得血清样本在10 min内即可观察检测结果。本研究发现，优化后检测牛赤羽病阳性血清灵敏度达1∶512，且该试纸条仅与AKAV N抗体牛血清反应。本研究使用的AKAV抗体检测试剂盒，是以纯化的AKAV病毒作为包被抗原，以抗Gc蛋白的单克隆抗体为竞争抗体建立了cELISA试剂盒。AKAV囊膜蛋白Gc可产生中和抗体，能够鉴别诊断施马伦贝格病毒抗体[11]。本试验试剂盒与试纸条检测40份牛血清的阳性符合率为92.6%，表明制备的试纸条可方便基层养殖户对赤羽病的初筛。4结论本研究制备的牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条操作简单，10~15 min即可获得结果，具有良好的敏感性和特异性。