我国驴养殖数量居世界首位，但目前缺乏驴饲养的营养标准，一般以小马需要量的75%进行饲喂。驴对蛋白质和能量的需求低于马，按照马的饲养标准饲喂会使其变得肥胖，导致驴产生高脂血症、椎板炎和马代谢综合征等疾病[1-2]。因此，在驴的饲养管理中应结合其消化特性供给粗饲料。驴的盲肠能够富集大量的拟杆菌属、瘤胃球菌属等具有发酵、分解功能的微生物，对粗饲料具有较强的降解利用能力。但与反刍动物相比，驴盲肠内的微生物区系活力偏弱，对粗饲料的消化利用低于反刍动物，且不同饲料原料的纤维物质也集中在盲肠和结肠降解。但目前关于驴粗饲料的研究较少，并且对驴发酵机理及发酵情况的研究更少，因此需要展开对盲肠降解能力和发酵情况的研究。Mariette等[3]和Fombelle等[4]发现，苜蓿草能够明显增加小马盲肠细菌总数，显著增加纤维分解菌的数目，从而有利于纤维素降解。纤维素是粗饲料中潜在的能量部分，在驴等马属动物盲肠发酵产生挥发性脂肪酸（VFA）和乳酸，随后被吸收和代谢产生能量，为动物机体供能[5]。氨态氮（NH3-N）、菌体蛋白（BCP）和VFA等是反映盲肠是否正常发酵的重要指标，能够体现发酵底物的营养价值。因此，本试验通过比较研究苜蓿、燕麦草、全株玉米青贮、羊草、玉米秸秆和谷草6种不同粗饲料经体外模拟胃-小肠降解后的残渣在驴盲肠的体外发酵参数，对不同粗饲料的营养价值进行评价。1材料与方法1.1试验动物选取4岁左右成年健康德州驴（体重为230~240 kg）为盲肠液的供体，屠宰，取盲肠内容物于39 ℃并通有CO2气体的保温瓶中，经2层纱布将盲肠液过滤于39 ℃并通CO2气体的保温瓶中保存。1.2试验设计采用单因素完全随机试验设计，每一种饲料作为一个处理，每个处理6个重复，以谷草为对照组。将经胃-小肠降解后的饲料残渣，在体外盲肠环境进行连续培养，每个处理培养48 h。1.3溶液配制1.3.1Menke缓冲液配制[6]微量元素溶液：称取13.2 g CaCl2∙2H2O、10 g MnCl2∙4H2O、1 g CoCl2∙6H2O及8 g FeCl3∙6H2O于烧杯中，使用蒸馏水溶解，定容至100 mL。缓冲溶液：称取35.0 g NaHCO3、4.0 g NH4HCO3于烧杯中，使用蒸馏水溶解后定容至1 000 mL。常量元素溶液C：称取5.7 g Na2HPO3、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4∙7H2O于烧杯中，使用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。刃天青溶液：称取100 mg刃天青，使用蒸馏水溶解，冷却，定容至100 mL。还原液：提前制备1 mol/L的NaOH溶液，在培养当天取4 mL NaOH溶液，625 mg Na2S∙9H2O加入95 mL水混匀。Menke缓冲液：Menke缓冲液配制体系见表1。将上述制备好的各试剂按表1（1 000 mL体系）比例混匀，在水浴锅中温热到38 ℃，持续通入CO2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.022.T001表 1Menke缓冲液配制体系（1 000 mL体系）项目体积合计1 000.00微量元素0.12缓冲溶液237.00常量元素液237.00刃天青溶液1.22蒸馏水474.00还原剂49.50mL1.3.2Kansas缓冲液配制Kansas缓冲液用于饲料样品的体外降解过程[7]，包括溶液A和溶液B，分别溶解后定容至1 L，Kansas缓冲液配制体系见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.022.T002表2Kansas缓冲液配制体系缓冲液A含量缓冲液 B含量KH2PO410.0Na2CO315MgSO4·7H2O0.5Na2S·9H2O1NaCl0.5CaCl2·2H2O0.1尿素0.5g/L1.3.3体外培养液配制模拟胃液的配制：将0.9 mL浓盐酸定容至1 000 L，将1 g胃蛋白酶（P110928，Aladdin）溶于1 L的盐酸溶液中。模拟小肠液的配制：称取9.47 g Na2HPO4于烧杯中，使用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL，称取9.08 g的KH2PO4于烧杯中，使用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL，将2种溶液以915∶85比例混匀，得到磷酸盐缓冲液。将3 g胰酶（P110505，Aladdin）和1 mL细菌生长抑制剂（0.5%氯霉素溶液）溶于1 L磷酸盐缓冲液中。体外盲肠液的组成：400 mL盲肠液、1 330 mL Kansas缓冲液A和266 mL Kansas缓冲液B。1.4样品采集与制备准确称取发酵底物（苜蓿、全株玉米青贮、谷草、玉米秸秆、燕麦草、羊草经胃-小肠消化后的残渣）1.00 g于100 mL的发酵瓶中。将Menke缓冲液与过滤后的盲肠液按照1∶2的比例混合，取60 mL分装到发酵瓶中，全程通入CO2，分装完成拧紧瓶盖，连接到产气全自动记录仪，39 ℃连续培养48 h，培养结束，发酵瓶冰浴，停止发酵。单层纱布过滤发酵液于50 mL离心管，测定pH值；取0.5 mL于含4.5 mL 0.2 mol/L盐酸的离心管中，用于测定氨态氮（NH3-N）；取4 mL于含1 mL 25%偏磷酸的离心管中，用于测定VFA；将剩余发酵液取5 mL于离心管用于BCP测定。-20 ℃保存。1.5盲肠体外发酵指标1.5.1pH值终止发酵后，使用预先校正的高精度便携式手持pH计测定pH值。1.5.2NH3-N含量采用比色法[8]测定NH3-N含量，取出冻存样品常温解冻后摇匀，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取100 µL上清加入1.5 mL离心管中，分别加入A液、B液各500 µL，涡旋混匀。取200 µL加入96孔板，静置10 min，700 nm测定OD值，通过标准曲线计算所测盲肠液中NH3-N含量。试剂A：称取0.08 g亚硝基铁氰化钠于100 mL 14%水杨酸钠溶液中溶解。试剂B：量取2 mL次氯酸钠溶液（含活性氟5.2%），混于100 mL 0.3 mol/L氢氧化钠溶液中混匀。1.5.3BCP含量采用考马斯亮蓝法（蛋白定量测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供）测定。将20 ℃样品取出，解冻，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取1 mL上清，4 ℃、12 000 r/min离心25 min，弃上清；加入1 mL 0.9%生理盐水冲洗沉淀，4 ℃、12 000 r/min离心20 min弃上清，重复上述清洗步骤一次；向菌体沉淀中加入1 mL细菌蛋白抽提液，用移液器上下吹打直至菌体完全重悬。重悬后室温孵育15 min，4 ℃、15 000×g离心5 min，取25 μL上清至2 mL离心管，加入1.5 mL考马斯亮蓝显色液，充分涡旋，静置10 min，取200 μL混匀液点入96孔板，于595 nm测定OD值，根据试剂盒说明书计算BCP含量。1.5.4VFA含量采用气相色谱法测定，参照秦为琳[9]的测定方法。冷冻样品常温解冻，4 000 r/min低温离心10 min，吸取上清1 mL于1.5 mL离心管中，加入200 µL内标溶液，涡旋混匀，10 000 r/min低温离心10 min，取上清过滤，用于测定乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸含量，并计算乙酸/丙酸和总挥发性脂肪酸（TVFA）。测定条件为色谱柱内径为0.25 mm、长60 m的毛细柱，柱流量1.30 mL/min；分流比为40，柱箱温度120 ℃。1.5.5产气量利用AGRS-Ⅲ型64通路微生物发酵微量产气全自动记录装置与软件系统，记录3、6、9、12、24、48 h的实时产气量。1.5.6多项组合效应值MFAE为多项不同组合（处理）的各指标单项组合效应值（SFAEI）之和[10]。SFAEI=∑m=1n(A2m-A1m)/nA¯2m (1)式中：m为各发酵时间点；n为发酵时间点的总次数；A1m为组合前（对照组）各单一指标n个发酵时间点的值，以谷草为对照组；A2m为组合后（试验组）各单一指标n个发酵时间点的值。1.6数据统计与分析试验数据采用Excel 2019进行统计，SAS 9.2软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较，结果以平均值和总标准误（SEM）表示。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同粗饲料对体外盲肠发酵pH值、NH3-N和BCP含量的影响（见表3）由表3可知，6种主要粗饲料在驴盲肠体外发酵48 h，苜蓿和谷草的pH值较高，显著高于全株玉米青贮与玉米秸秆（P0.05）。苜蓿的NH3-N含量最高，显著高于谷草和玉米秸秆（P0.05）。谷草的BCP含量最低，显著低于其他粗饲料（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.022.T003表3不同粗饲料对体外盲肠发酵pH值、NH3-N和BCP含量的影响项目玉米秸秆谷草苜蓿燕麦草羊草全株玉米青贮SEMP 值pH值6.43b6.54a6.54a6.52ab6.52ab6.27c0.030.001NH3-N/(mg/100 mL)15.44c17.36b20.06a19.15ab19.10ab18.25ab0.450.001BCP/(mg/100 mL)0.90a0.81b0.95a0.94a0.95a0.99a0.020.001注：同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.2不同粗饲料对体外盲肠发酵产气量的影响（见表4）由表4可知，整个发酵过程中，不同粗饲料的产气量逐渐增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.022.T004表4不同粗饲料对体外盲肠发酵产气量的影响培养时间/h玉米秸秆谷草苜蓿燕麦草羊草全株玉米青贮SEMP 值34.42b4.99b13.79a6.43b6.75b4.17b0.730.001611.66b10.13bc35.33a13.90b10.75bc6.03c1.410.001927.54b18.17c47.95a26.75b16.46c11.81c2.010.0011236.99b26.08cd52.03a34.50bc23.21d27.73cd2.650.0012444.48ab35.45b55.87a43.14ab38.34b53.16a3.890.0144846.61ab39.90b60.52a49.72ab47.43ab58.13a4.330.091mL体外发酵3、6、9、12 h，苜蓿的产气量显著高于谷草、全株玉米青贮、玉米秸秆、燕麦草和羊草（P0.05）；体外发酵24 h，谷草和羊草的产气量显著低于苜蓿和全株玉米青贮（P0.05）；体外发酵48 h，谷草的产气量具有低于苜蓿和全株玉米青贮的趋势。2.3不同粗饲料对体外盲肠发酵VFA、TVFA与乙酸/丙酸的影响（见表5）由表5可知，乙酸含量以苜蓿和燕麦草较高，显著高于谷草、全株玉米青贮、玉米秸秆和羊草（P0.05），玉米秸秆最低；全株玉米青贮和燕麦草的丙酸含量较高，显著高于其他粗饲料（P0.05），以谷草最低；异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和TVFA含量均以燕麦草最高，显著高于其他粗饲料（P0.05）；乙酸/丙酸的数值以苜蓿和谷草较高，显著高于全株玉米青贮、玉米秸秆、燕麦草和羊草（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.022.T005表5不同粗饲料对体外盲肠发酵VFA、TVFA与乙酸/丙酸的影响项目玉米秸秆谷草苜蓿燕麦草羊草全株玉米青贮SEMP 值乙酸/(mmol/L)39.51c40.81c46.11a55.62a43.94b44.64c0.780.001丙酸/(mmol/L)15.09bc13.89c14.73bc20.66a15.84b21.77a0.370.001异丁酸/(mmol/L)0.50d0.51cd0.62b0.74a0.55cd0.57bc0.020.001丁酸/(mmol/L)5.38b4.94c5.70b7.79a5.43b5.52b0.120.001异戊酸/(mmol/L)0.68c0.69c0.86b1.20a0.72c0.73c0.020.001戊酸/(mmol/L)0.42c0.41c0.52b1.12a0.43c0.42c0.010.001TVFA/(mmol/L)61.12d61.21d67.87c87.12a66.90c73.64b1.140.001乙酸/丙酸2.77b2.94a3.05a2.70b2.78b2.06c0.050.0012.4不同粗饲料的SFAEI与MFAEI结果（见表6）由表6可知，驴主要粗饲料的MFAEI排序为苜蓿燕麦草全株玉米青贮羊草玉米秸秆谷草。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.022.T006表 6不同粗饲料的SFAEI与MFAEI结果项目谷草玉米秸秆苜蓿燕麦草羊草全株玉米青贮BCP00.1030.1490.1420.1490.184NH3-N0-0.1250.1630.0930.0910.049TVFA0-0.0010.0980.2970.0850.169产气量00.2150.4930.2280.1230.163MFAEI00.1920.9030.7600.4480.5653讨论3.1不同粗饲料对体外盲肠发酵pH值、NH3-N和BCP含量的影响驴属于后肠发酵动物，其发达的盲肠具有与反刍动物瘤胃类似的作用，是纤维素被微生物发酵、分解、消化的部位。目前关于驴盲肠发酵的研究尚少，已有研究直接将饲料原料作为发酵底物进行体外盲肠发酵[11]。本试验将经胃-小肠降解后的饲料残渣作为发酵底物，进行粗饲料盲肠体外发酵特性的研究，理论上分析，本试验方法更加贴近驴的消化生理特点。pH值作为维持盲肠内环境稳态的重要指标之一，微生物正常活动的pH值范围为5.5~7.5[12]。当pH值维持在有利于肠道微生物生存的正常范围内时，盲肠发酵才能正常进行。本试验测得发酵液的pH值为6.26~6.54，表明不同粗饲料的盲肠体外发酵环境均处于稳定状态。NH3-N含量在6.3~27.5 mg/100 mL时，为微生物的最适生长浓度[13]。NH3-N含量过高会造成氮流失，过低会抑制微生物正常生长繁殖。本试验中，粗饲料的NH3-N含量均处于最适范围。与反刍动物瘤胃发酵相比，关于驴等马属动物的盲肠体外发酵相关研究有限，尤其是针对驴盲肠中NH3-N浓度的研究更少。Devant等[14]研究发现，日粮蛋白含量提高后，反刍动物瘤胃内的NH3-N含量随蛋白含量增加而增加。本试验中，经胃-小肠降解后，苜蓿、燕麦草、羊草和全株玉米青贮残渣中CP含量较高，分别为2.41%、3.10%、2.84%和2.22%；发酵后的NH3-N含量也较高。玉米秸秆和谷草残渣中CP含量较低，分别为1.40%和1.86%；发酵后的NH3-N含量也低，与Devant等[14]的研究结论一致。NH3-N作为合成BCP主要的氮源，BCP含量会随NH3-N含量提高而增加，但NH3-N会随着被微生物利用、机体吸收、代谢等方式逐渐减少。3.2不同粗饲料对体外盲肠发酵产气量的影响在体外发酵试验中，产气量是衡量饲料降解率的重要指标之一。有研究表明，产气量增加表明微生物活性增强，饲料降解率会提高[15]。杨建中等[16]利用体外产气法研究苜蓿干草与小麦秸秆的组合效应时发现，苜蓿干草组的产气量和产气速率均高于苜蓿与小麦秸秆的混合组和单一的小麦秸秆组，与本试验研究结果一致，表明苜蓿较其他5种粗饲料更容易被微生物降解，生成短链脂肪酸或甲烷。3.3不同粗饲料对体外盲肠发酵VFA的影响VFA是草食动物主要的能量来源，乙酸、丙酸、丁酸是微生物消化代谢的主要VFA产物，占TVFA的95%[17]。乙酸是动物机体合成乳脂肪和体脂肪的原料[18]，丙酸能够促进葡萄糖的转运与储存，丁酸经吸收后可以为体组织提供能量[19]。Murray等[20]研究马盲肠发酵时得出，以禾本科牧草为发酵底物、以冷冻粪便为微生物接种物，体外培养120 h，TVFA含量（45.1 mmol/L）低于本试验结果，本试验盲肠发酵液pH值低于Murray等[20]的试验结果（pH值7.16）。本试验以燕麦草为发酵底物的TVFA浓度显著高于其他饲料，表明驴盲肠对燕麦草的发酵有一定促进作用。乙丙比作为衡量碳水化合物在瘤胃发酵模式的重要指标[21]，可以反映盲肠中的发酵情况。当丙酸产量较高，乙丙比≤2.5时为丙酸型发酵，此时动物可以利用丙酸合成更多的葡萄糖，为机体节省生糖氨基酸。本试验只有当全株玉米青贮为发酵底物时，乙丙比小于2.5，表明饲喂全株玉米青贮可以改善盲肠发酵模式，提高饲料能量利用率。苜蓿、谷草、玉米秸秆、羊草和燕麦草为发酵底物时，乙丙比均大于2.5，为乙酸型发酵。有报道表明，粗饲料过多会导致乙酸偏高[22]，解释了本试验中发酵底物只有粗饲料，从而产生乙酸含量高的现象。3.4不同粗饲料体外盲肠发酵指标组合效应的综合评价SEAEI可以在某一指标上评价饲料，但从某一指标来判断饲料营养价值，缺乏代表性[23]，造成评价不准确。本试验采用卢德勋提出的MFAEI，通过计算各粗饲料的SEAEI和MFAEI，发现驴主要粗饲料的MFAEI从高到低依次为苜蓿、燕麦草、全株玉米青贮、羊草、玉米秸秆和谷草，表明6种粗饲料的营养价值由高到低依次为苜蓿、燕麦草、全株玉米青贮、羊草、玉米秸秆和谷草。在驴的养殖生产中，苜蓿、燕麦草、全株玉米青贮和羊草可以作为较好的饲草资源供给。4结论综合粗饲料的盲肠发酵指标的结果和MFAEI得出，苜蓿、燕麦草、全株玉米青贮和羊草的体外盲肠发酵效果较好，玉米秸秆和谷草的效果较差。