黑水虻属腐生性水虻科昆虫，不携带病菌且对人畜无危害，在我国沿海地区广泛分布[1]。研究表明，黑水虻幼虫粉蛋白质含量为31.7%~47.6%，风干脱脂虫粉蛋白质含量可高达63.9%[2]，且黑水虻幼虫粉中微量元素、酪氨酸、脯氨酸等含量高于鱼粉，具有极高的研究价值[3]。黑水虻幼虫粉在畜禽养殖中作为蛋白饲料替代豆粕具有较高的可行性[4-6]。研究表明，黑水虻幼虫粉可替代水产饵料中鱼粉，且对动物生产性能和健康水平无明显的负面作用[7]。鱼粉是大菱鲆饵料中蛋白的主要来源，寻找新的蛋白源合理替代大菱鲆饵料中的鱼粉可以提高大菱鲆的养殖经济效益[8]。因此，本研究使用黑水虻幼虫粉部分替代大菱鲆饵料中鱼粉，观察其对大菱鲆生长性能及血清生化指标的影响，为降低大菱鲆的养殖成本提供参考。1材料与方法1.1试验材料黑水虻虫粉购自生物源生物技术（深圳）股份有限公司，粗蛋白含量为56%，粗脂肪含量约为7%。大菱鲆幼鱼由海南临高海丰养殖发展有限公司提供，平均个体体重约为7.24 g。1.2试验设计选取240尾大菱鲆幼鱼，随机分为4组，每组6个重复，每个重复10尾鱼。对照组鱼饲喂基础饵料，15%组、30%组、45%组分别使用15%、30%、45%的黑水虻幼虫粉替代基础饵料中的鱼粉。试验饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.016.T001表1试验饵料组成及营养水平项目对照组15%组30%组45%组原料组成白鱼粉50.042.535.027.5黑水虻幼虫粉07.515.022.5大豆浓缩蛋白20.020.020.020.0α-淀粉11.511.511.511.5乌贼肝粉5.05.05.05.0谷朊粉3.03.03.03.0鱼油3.63.63.63.6豆油3.23.23.23.2沸石粉0.60.60.60.6磷酸氢钙0.60.60.60.6大豆卵磷脂1.01.01.01.0氯化胆碱0.50.50.50.5预混料1.01.01.01.0合计100.0100.0100.0100.0营养水平粗蛋白48.4648.3048.1447.95粗脂肪10.3710.3610.3610.35粗灰分11.2610.8710.4410.02注：1.预混料为每千克饵料提供：VA 5 500 IU、VD3 1 100 IU、VK3 1.35 mg、VB2 3.3 mg、VB1 1.05 mg、泛酸2.35 mg、VB6 0.75 mg、烟酸1.0 mg、生物素0.95 mg、VC 5 mg、Cu 4.15 mg、Fe 1.86 mg、Zn 10.5 mg、Mn 10.83 mg、I 0.3 mg、Se 0.2 mg。2.营养水平均为实测值。%1.3饲养管理试验在海南热带海洋学院水产养殖实验室进行，大菱鲆于水族箱（60 cm×40 cm×50 cm）中养殖，每个水族箱中放置10尾大菱鲆。养殖用水为经过沉淀、砂滤及紫外消毒后的海水，每日换水2次，全天供氧，水中氧溶解度大于7.0 mg/L，氨氮浓度不超过0.02 mg/L，盐度为25‰~30‰，水温保持在18 ℃左右，pH值为7.6~8.0。每日7：00和19：00进行投料，投料量约为大菱鲆体重3%~4%，根据每日采食情况调整饲喂量，对死亡大菱鲆及时称重并处理。预试期7 d，正式试验期60 d。1.4测定指标及方法1.4.1样品收集饲喂试验开始与结束前24 h对试验大菱鲆进行禁食处理，称重。每个水族箱中随机选择5尾大菱鲆，鱼尾静脉抽血，静置2 h，3 500 r/min离心10 min，获得血清，置于-20 ℃冰箱中保存，测定大菱鲆体长，剖取内脏称重，将肝脏分离并称重。1.4.2生长性能饲喂试验结束后，测定增重率（WGR）、存活率（SR）、饲料系数（FCR）、特定生长率（SGR）、肥满度（CF）、肝体指数（HSI）、内脏指数（VSI）。WGR=W末-W始/W始×100%(1)SR=N末-N始/N始×100%(2)FCR=FI/W末-W始 (3)SGR=lnW末-lnW始/t (4)CF=W末/L末3 (5)VSI=W脏/W末×100%(6)HSI=W肝/W末×100%(7)式中：W末为试验末重（g）；W始为试验初重（g）；N末为试验末大菱鲆数量；N始为试验初大菱鲆数量；FI为试验阶段采食量（g）；t为试验时间；L末为试验末大菱鲆平均体长（cm）；W脏为内脏质量（g）；W肝为肝脏质量（g）。1.4.3血清抗氧化指标总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体步骤参照试剂盒说明书。1.4.4非特异性免疫指标溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、补体C3含量使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体步骤参照试剂盒说明书。1.4.5血清生化指标使用7020型全自动生化分析仪测定谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活性以及总蛋白（TP）、甘油三酯（TG）及总胆固醇（TC）含量。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体步骤参照试剂盒说明书。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行初步整理，SAS 9.2软件进行单因素方差分析，Duncan's进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1黑水虻幼虫粉替代鱼粉对大菱鲆生长性能的影响（见表2）由表2可知，45%组大菱鲆试验末重、WGR、CF均显著低于对照组和15%组（P0.05），30%组和45%组大菱鲆HSI显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.016.T002表2黑水虻幼虫粉对大菱鲆生长性能的影响项目对照组15%组30%组45%组初重/g7.30±0.227.29±0.157.28±0.187.31±0.19末重/g22.13±0.28a22.12±0.39a21.87±0.21a21.36±0.35bWGR/%202.74±9.86a203.43±10.24a200.41±7.53a182.20±8.17bSR/%98.33±3.7398.33±3.7396.67±4.7193.33±4.71FCR1.06±0.091.08±0.111.11±0.121.15±0.13SGR/(%/d)1.85±0.121.85±0.191.83±0.131.78±0.15CF/(g/cm3)3.02±0.11a2.96±0.09a2.88±0.13ab2.74±0.08bVSI/%4.55±0.354.52±0.174.53±0.244.56±0.36HSI/%1.12±0.06a1.06±0.05ab0.95±0.07b0.84±0.06b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2黑水虻幼虫粉替代鱼粉对大菱鲆血清抗氧化指标的影响（见表3）由表3可知，15%组和30%组大菱鲆血清T-AOC、GSH-Px活性显著高于对照组（P0.05）；各试验组大菱鲆血清SOD活性显著高于对照组（P0.05），MDA含量均显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.016.T003表3黑水虻幼虫粉对大菱鲆血清抗氧化指标的影响组别T-AOC/(U/mL)CAT/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)SOD/(U/mL)MDA/(μmol/L)对照组2.89±0.32b4.68±0.45368.81±20.81c99.43±3.93c8.51±0.67a15%组3.85±0.37a4.81±0.51467.56±26.48b108.65±2.62b7.32±0.48b30%组4.36±0.45a4.92±0.39537.14±33.25a121.34±3.85a6.68±0.35c45%组3.46±0.38ab4.76±0.36423.70±31.69bc106.96±2.76b5.67±0.43d注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4、表5与此同。2.3黑水虻幼虫粉替代鱼粉对大菱鲆非特异性免疫指标的影响（见表4）由表4可知，各试验组大菱鲆血清补体C3含量均显著高于对照组（P0.05），45%组大菱鲆血清ALP活性显著高于对照组（P0.05），30%组和45%组大菱鲆血清ACP活性显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.016.T004表4黑水虻幼虫粉对大菱鲆血清非特异性免疫指标的影响组别LZM/(U/mL)ACP/(金氏单位/L)ALP/(金氏单位/L)补体C3/(mg/L)对照组17.85±2.819.57±0.47b16.88±0.97b168.66±9.77d15%组18.48±3.469.82±0.65b17.59±1.01b289.45±18.43c30%组18.87±4.1110.87±0.58a18.81±1.74ab427.91±20.56b45%组19.59±3.9711.46±0.61a20.27±0.95a765.43±40.37a2.4黑水虻幼虫粉替代鱼粉对大菱鲆血清生化指标的影响（见表5）由表5可知，15%组和30%组大菱鲆血清TP含量显著高于对照组（P0.05）；30%组大菱鲆血清ALT活性显著高于对照组（P0.05）；各试验组大菱鲆血清TC含量低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.016.T005表5黑水虻幼虫粉替代鱼粉对大菱鲆血清生化指标的影响组别TP/(g/L)AST/(U/L)ALT/(U/L)TG/(mmol/L)TC/(mmol/L)对照组23.56±1.07c120.73±5.611.63±0.29b8.12±0.955.83±0.34a15%组26.87±1.23b122.39±4.381.86±0.17ab7.94±0.735.01±0.27b30%组30.58±2.38a125.86±7.282.30±0.38a7.67±0.624.85±0.30b45%组24.64±1.53bc119.47±9.461.82±0.23ab7.52±0.664.91±0.41b3讨论3.1黑水虻幼虫粉替代鱼粉对大菱鲆生长性能的影响黑水虻幼虫粉作为水产饵料蛋白来源已经有初步研究。贲玲芝等[9]分别使用不同比例全脂黑水虻幼虫粉（0、20%、40%及40%+赖氨酸+蛋氨酸）替代饵料中鱼粉，结果发现，鱼粉替代比例为40%时，试验大菱鲆的末重、WGR、SGR均显著低于对照组，与本研究结果类似。邬伊田等[10]使用脱脂黑水虻虫粉替代大口黑鲈日粮中25%、50%和75%的鱼粉，结果表明，25%组黑鲈WGR和摄食率显著高于50%组，且50%和75%组黑鲈肝体比显著高于对照组。张雯等[11]使用黑水虻幼虫粉替代鲈鱼饵料中10%和20%鱼粉，结果表明，试验各组鲈鱼的生长性能无明显差异。因此，在水产饵料中以较低比例黑水虻虫粉替代鱼粉对水产动物的生长性能无负面作用，当添加量过高时会存在一定的负面作用，原因可能是黑水虻虫粉的赖氨酸和蛋氨酸含量低于鱼粉所致[12]。3.2黑水虻幼虫粉对大菱鲆血清抗氧化指标的影响动物生长和代谢过程中氧化产生的·O2-自由基、DPPH自由基等易造成细胞损伤，危害动物生产性能与健康，机体内抗氧化酶活性越高表示清除自由基能力越强，能够在一定程度上反映机体的健康水平[13]。MDA是脂类物质氧化反应产物，可以反映体内氧化反应程度[14]。贲玲芝等[9]研究发现，添加黑水虻虫粉对大菱鲆血清中SOD活性和MDA含量无明显影响，而本研究的结果与贲玲芝等[9]相反，原因可能是黑水虻脱脂后几丁质等活性物质含量上升所致。李雪婷[15]使用脱脂黑水虻幼虫粉替代半滑舌鳎饵料中25%、50%、75%、100%鱼粉，结果表明，各试验组半滑舌鳎血清的T-AOC以及SOD、CAT的活性显著高于对照组，且MDA含量显著低于对照组。彭凯等[16]研究认为，使用脱脂黑水虻幼虫粉替代加州鲈饵料中7.5%~30.0%比例的鱼粉均可显著提高鲈鱼血清中GSH-Px活性。上述研究结果表明，脱脂与未脱脂黑水虻幼虫粉提升鱼类动物血清抗氧化活性的效果存在差异。3.3黑水虻幼虫粉对大菱鲆血清非特异性免疫的影响LZM源自吞噬细胞，可直接攻击革兰氏阴性菌细胞壁的β-1,4糖苷键结构，同时可水解致病菌的黏多糖，对病原微生物具有较强的抑制作用[17]。C3是血清中含量最高的补体成分，属于重要的非特异性免疫因子；ALP和ACP属于水解酶，对病原微生物在溶酶体内的消化降解具有重要作用[18]。彭凯等[16]研究发现，添加黑水虻虫粉可以增加加州鲈血清补体C3含量和ACP活性。马恒甲等[19]分别使用黑水虻干虫和虫粉分别等量替代乌鳢饵料中50%鱼粉，结果发现，试验组乌鳢血清中抗氧化能力显著上升，ACP活性及补体C3和C4的含量显著高于对照组。石洪玥等[20]对锦鲤分别直接投喂黑水虻幼虫和干虫，结果发现，试验组锦鲤AKP活性显著高于对照组。孙学亮等[21]研究发现，鹦鹉鱼对黑水虻的摄入量越高，其血清中LSZ活性越高。本研究结果显示，大菱鲆饵料中用黑水虻幼虫粉替代鱼粉可提高其ACP、ALP活性和补体C3含量，与上述研究结果类似。3.4黑水虻幼虫粉对大菱鲆血清生化指标的影响血清TP是由白蛋白和球蛋白构成，可以反映机体对蛋白质代谢情况，合理范围内TP升高表明蛋白合成能力有所提升；ALT和AST主要参与体内转氨基作用，当肝脏细胞受损时会导致血清中活性上升；TG和TC升高表明机体脂质代谢功能紊乱，肝功能受损[22-23]。贲玲芝等[9]研究表明，使用全脂黑水虻粉替代饵料中20%鱼粉，可以显著提高TC含量，但本研究结果与之相反，原因是本研究使用了粗脂肪含量较低的脱脂黑水虻幼虫粉。萧鸿发[24]使用黑水虻幼虫粉分别替代大口黑鲈饵料中7.5%、15%、22.5%和30%的鱼粉，结果表明，随着替代比例上升，大口黑鲈血清中TP含量呈先升后降的趋势，并以22.5%组最高；ALP活性同样呈先上升后下降的趋势，但30%组显著低于对照组；除了7.5%组外，其他试验组ACP活性显著高于对照组，与本研究结果相似。4结论本试验发现，使用黑水虻替代鱼粉对大菱鲆生长性能与健康无明显负面作用，但过高的替代比例会造成大菱鲆生产性能降低。因此，综合认为使用黑水虻幼虫粉替代日粮中30%鱼粉效果较好。