黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮是目前对养殖业危害最大的主要霉菌毒素[1]。黄曲霉毒素B1是黄曲霉菌等真菌产生的次生代谢产物，是一种天然存在的、毒性极强的物质[2]，通过饲料进入动物体内可导致动物生产性能、繁殖力降低以及疾病易感性增强等急性、慢性中毒症状[3]。玉米赤霉烯酮主要由镰刀菌产生，具有高毒性，广泛存在于玉米、小麦等饲料原料中[4]，可引起家禽雌激素亢进症，还可引起大脑神经化学物质分泌发生改变，导致动物不食、呕吐、肌肉协调性降低与嗜睡[5]。饲料原料在生产、贮存、运输等过程中，受气候、季节、加工不当等因素影响，极易发生霉变而产生霉菌毒素[6]。鉴于霉菌毒素的污染已对饲料安全产生潜在威胁，《饲料卫生标准》对不同种类的饲料原料和饲料产品中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的限量值作出了相应的规定[7]。黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的检测方法主要包括胶体金法[8]、薄层分析法[9]、酶联免疫法[10]、荧光分光光度法[11]、高效液相色谱法[12]、液相色谱-串联质谱法[13]以及核酸适配体、时间分辨荧光等新型检测技术[14]。其中高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法是目前最常用的测定饲料中霉菌毒素的方法[15]，采用液相色谱-串联质谱法测定霉菌毒素时无须进行柱前或柱后衍生处理，操作相对简单，与其他方法相比具有更高的灵敏度和准确性[16]。本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱检测不同饲料基质中的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量，为相关研究与应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料黄曲霉毒素B1（98.5%）、玉米赤霉烯酮（98.5%），购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈均为色谱醇，购自Fisher公司；甲酸、乙酸铵均为色谱纯，购自Sigma公司；多功能净化柱购自Romer公司。1.2仪器设备MS205DU电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、VX-Ⅲ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）、Thermo sorvall高速冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技公司）、SI-A256涡旋混合器（美国SI公司）、Agilent 6460高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（美国安捷伦科技公司）。1.3试验方法1.3.1混合标准储备溶液配制准确称取适量的黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮标准品于棕色容量瓶中，采用甲醇溶解定容，配制成浓度100 µg/mL的标准储备溶液，-20 ℃保存。1.3.2混合标准中间溶液配制移取适量100 µg/mL黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮标准储备液，采用甲醇进行稀释，配制成浓度1.0 µg/mL的标准中间溶液，4 ℃保存。1.3.3液相条件色谱柱：EclipsePlus C18 RRHD柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 µm）；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 µL。流动相：以0.2%甲酸乙腈溶液为流动相A，以10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.T001表1梯度洗脱程序序号时间/min流速/(mL/min)A/%B/%100.359529.000.359539.100.31000411.000.31000511.100.3595614.000.35951.3.4质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正、负离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；毛细管电压正模式4.0 kV，负模式3.5 kV；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：9 L/min；雾化压力：310 kpa。监测离子参数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.T002表2监测离子参数项目定性离子对荷质比定量离子对荷质比毛细管出口端电压/V碰撞能量/eV离子模式黄曲霉毒素B1313.1285.1313.1241.113020ESI+13035玉米赤霉烯酮317.0175.0317.0131.019016ESI-190241.3.5样品前处理称取（2.000 0±0.000 1）g按GB/T 20159—2006 动物饲料试样规定制备的样品，于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入20 mL乙腈-水溶液（84∶16），涡旋混匀2 min，置于多管涡旋振荡器中振荡10 min，取出，于8 000 r/min离心5 min，上清液待净化。移取5 mL上清液过ROMER MycoSep 226净化柱，取过柱后的1 mL净化液加入1 mL 0.2%甲酸乙腈溶液稀释，涡旋混匀，进行UPLC/MS分析。1.3.6基质匹配标准工作溶液配制称取空白饲料样品，按照样品前处理步骤制得多个空白基质样品溶液，准确移取1.0 µg/mL混合标准中间液适量，采用空白基质样品溶液稀释定容至2 mL，配制成0.5、1.0、2.0、10、20、50 μg/L的基质匹配标准溶液。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、标准溶液质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线。2结果与分析2.1质谱条件优化结果根据化合物的性质和结构特征，黄曲霉毒素B1易结合H+，玉米赤霉烯酮易失去H+[17]。因此，同时选择ESI+和ESI-离子模式，对两种化合物的质谱条件进行优化。通过对1.0 μg/mL的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的标准溶液进行全扫描，选择合适的母离子，通过优化碰撞能量选择相对丰度最高的子离子作为定量离子，其次作为定性离子。通过优化毛细管出口端电压、碰撞能量等条件，得到多反应监测（MRM）色谱图，见图1、图2。由图1、图2可知，上述质谱条件能够满足黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的同步检测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.F001图1黄曲霉毒素B1定量离子色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.F002图2玉米赤霉烯酮定量离子色谱图2.2液相条件优化结果超高效液相色谱-质谱联用分析中常用的流动相体系主要有乙腈-水、甲醇-水体系。乙腈作为流动相时的离子化程度高，响应值、灵敏度均比甲醇好[18]。黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮需要同时在正、负离子扫描模式下进行，一般正离子模式下需要加入甲酸、负离子模式下需要加入醋酸铵促进离子化程度。因此，本研究选择0.2%甲酸乙腈溶液和10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，梯度洗脱，两组分分离效果良好，峰形对称。2.3前处理条件优化结果与传统的多功能净化柱相比，本研究采用ROMER MycoSep 226多功能净化柱，样品提取液过柱后可直接稀释后上机测定，不需要进行氮气吹干浓缩等过程，提高了前处理的效率，减少了目标物质在前处理过程中的损失，能够满足对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮回收率的要求。2.4基质效应分析结果张大伟等[19]研究表明，检测饲料原料、饲料成品中真菌毒素时，黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮均呈现基质抑制效应。杨燕[20]考察玉米、稻谷、小麦中玉米赤霉烯酮测定时的样品基质效应，结果表明，基质对目标物的测定存在干扰，为抑制效应。为减少基质效应的影响，本研究采用空白样品基质匹配标准曲线，外标法定量。2.5方法学考察结果2.5.1线性范围、检出限和定量限结果采用空白基质溶液配制成0.5~50.0 μg/L标准曲线供UPLC/MS检测。以定量离子响应值为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图3、图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.F003图3黄曲霉毒素B1基质匹配标准曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.F004图4玉米赤霉烯酮基质匹配标准曲线由图3、图4可知，黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.999 0。以3倍的信噪比（S/N）确定检出限、10倍信噪比确定定量限，黄曲霉毒素B1检出限和定量限分别为1.0 μg/kg、2.0 μg/kg，玉米赤霉烯酮检出限和定量限分别为5.0 μg/kg、10.0 μg/kg，均满足国家标准的相关限量标准要求。2.5.2回收率和精密度检测结果选取配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料等3类空白样品，每类样品选取两种样品，分别制成低、中、高3个不同浓度的标准添加样品，进行加标回收试验。按上述试验方法进行处理和测定，每个水平平行测定6次，方法回收率与精密度结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.T003表3不同饲料添加水平、回收率及精密度结果（n=6）项目样品类别5 μg/kg10 μg/kg50 μg/kg回收率RSD回收率RSD回收率RSD黄曲霉毒素B1仔猪配合饲料81.81.290.43.489.62.2肉鸡中期配合料82.73.086.34.389.92.8育成鸡复合预混料84.02.689.92.190.71.5肉鸭复合预混料83.74.284.64.587.83.3育肥猪浓缩饲料84.91.991.63.091.02.7蛋鸡产蛋期浓缩料86.42.788.22.688.02.7玉米赤霉烯酮仔猪配合饲料86.83.386.41.690.34.1肉鸡中期配合料86.32.684.52.588.03.1育成鸡复合预混料85.82.990.00.9892.32.1肉鸭复合预混料86.82.185.42.089.23.8育肥猪浓缩饲料85.93.292.22.593.92.9蛋鸡产蛋期浓缩料86.44.087.93.090.33.8%由表3可知，添加浓度在5~50 μg/kg范围内，黄曲霉毒素B1的回收率在81.8%~91.6%，精密度（RSD）在1.2%~4.5%；玉米赤霉烯酮的回收率在84.5%~93.9%，精密度（RSD）在0.98%~4.10%。2.5.3实际样品检测结果分析本研究收集了88批次蛋鸡产蛋期配合饲料，按照上述方法测定了黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量，结果见表4，阳性样品色谱图见图5、图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.T004表488批次样品检测结果分析项目检出批次检出含量范围/(μg/kg)不合格批次不合格含量/(μg/kg)合格率/%黄曲霉毒素B183.00~28.30323.296.627.128.3玉米赤霉烯酮7012.00~4 640.002812.097.94 640.010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.F005图5样品中黄曲霉毒素B1定量离子色谱图（含量28.3 μg/kg）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.025.F006图6样品中玉米赤霉烯酮定量离子色谱图（含量4 640.00 μg/kg）由表4可知，根据《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）中限量规定值，88批次样品中黄曲霉毒素B1有3批次不合格，不合格率为3.4%，最高检出含量为28.3 μg/kg；玉米赤霉烯酮有2批次不合格，不合格率为2.1%，最高检出含量为4 640 μg/kg。3结论本研究基于多功能净化柱前处理技术，建立了一种针对饲料中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮同步检测的液相色谱串联质谱的检测方法，试样经提取后使用多功能净化柱净化，不需要进行氮吹、浓缩等过程，可直接稀释定容后上机测定，有效解决了传统方法步骤烦琐、耗时长的缺点，减少了目标物在氮吹过程中的损失。在0.5~50.0 μg/L范围内，黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮基质匹配标准曲线线性关系良好，相关系数R2≥0.999 0；黄曲霉毒素B1的空白样品平均加标回收率≥81.8%，RSD≤4.5%；玉米赤霉烯酮的空白样品平均加标回收率≥84.5%，RSD≤4.1%。该方法的提取步骤科学合理，易于掌握；检测数据重现性好、灵敏度高；添加回收率均可满足要求。