在当前高度集约化的现代养殖条件下，高密度饲养、通风不良、缺乏运动、高能饲粮日粮等不良因素导致在养殖过程中普遍存在氧化应激，使畜禽机体免疫力及生产性能受到严重影响[1]，在畜牧生产中使用抗氧化剂可以缓解氧化应激。但许多合成抗氧化剂具有潜在毒性和致癌作用，其安全性受到质疑[2-3]。因此，开发天然安全无毒的中草药抗氧化剂成为研究的热点。连翘为木犀科连翘属植物，具有清热解毒、消肿散结的功效[4]。现代研究表明，连翘叶中的主要成分包括木脂素类[5-6]、苯乙醇苷类[7-8]、黄酮[9]、三萜酸[10]等，具有抗菌[11]、抗氧化[12]、保肝[13]和调节免疫[14]等功效。在我国河北、陕西等地有将连翘叶制成茶作为保健饮料饮用的习惯。2018年，国家卫健委批准连翘叶作为新食品原料，极大地促进了连翘叶的开发。目前，关于连翘叶的研究多集中于连翘果和叶等所含化学成分及结构定性定量的测定，而对连翘叶中实际发挥功效的药效物质基础研究较少。本试验以化学法、巨噬细胞RAW264.7模型为评价方法，对连翘叶中7种成分连翘苷（PHI）、连翘脂素（PHG）、松脂素-β-D-葡萄糖苷（PIN）、连翘酯苷A（FSA）、连翘酯苷B（FSB）、连翘酯苷H（FSH）和连翘酯苷I（FSI）的抗氧化活性进行研究，筛选出其抗氧化的主要药效物质，探讨了其抗氧化的作用效果，以期为连翘叶在畜禽生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料连翘叶采自河南栾川，自然晒干，粉碎，过20目筛。RPMI1640培养液、青链双抗和胎牛血清购自gibco公司，CCK-8试剂购自大连美仑生物技术有限公司，抗坏血酸、H2O2溶液购自美国Sigma公司，DPPH溶液购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，ABTS试剂盒、·O2-试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。NBS-U410型超低温冰箱、NBS-170S型二氧化碳培养箱购自德国Eppendorf公司，1300 SERIES A2型生物安全柜购自美国Thermo Scientific公司，CKX41-A32PC型倒置显微镜购自日本Olympus Corporation公司，Imark酶标仪购自美国Bio-Rad Laboratories公司。1.2测定指标及方法1.2.1样品制备前期研究中[15]采用D101大孔树脂法、硅胶柱色谱法和HPLC半制备等多种方法对连翘叶进行提取分离纯化，并通过MS、NMR等方法鉴定，得到了12个化合物分别为芦丁、PHI、PHG、PIN、表松脂素-β-D-葡萄糖苷、表松脂素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、forsythensid F、（+）-1-羟基松脂素-4"-O-β-D-葡萄糖苷、FSI、FSH、FSA、FSB。本研究选取其中的7种成分PHI、PHG、PIN、FSI、FSH、FSA、FSB进行抗氧化活性研究。1.2.2体外抗氧化活性1.2.2.1DPPH自由基清除能力采用DPPH自由基清除试验检测连翘叶中7种成分的抗氧化活性。每种成分分别配制为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 g/L的样品溶液（乙酸乙酯溶解）。取200 μL不同质量浓度样品溶液于EP管中加入1 mL乙酸乙酯和4 mL DPPH溶液（1×104 mol/L乙酸乙酯溶解）振荡混匀，室温避光静置反应30 min；空白管中加入1.2 mL乙酸乙酯和4 mL DPPH溶液，对照管中加入200 μL不同质量浓度的样品溶液和5 mL乙酸乙酯溶液，在517 nm波长处测定吸光度，计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(K)=[1-(A1-A2)/A0]×100%(1)式中：A1为200 μL样品溶液＋1 mL乙酸乙酯+4 mL DPPH溶液（乙酸乙酯溶解）的吸光度；A2为200 μL样品溶液＋5 mL乙酸乙酯溶液的吸光度；A0为1.2 mL乙酸乙酯＋4 mL DPPH溶液（乙酸乙酯溶解）的吸光度。1.2.2.2ABTS自由基清除能力采用ABTS自由基清除能力试剂盒检测连翘叶中7种成分的抗氧化活性。每种成分分别配制为0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、1.500 0、2.000 0 g/L的样品溶液。取10 μL不同质量浓度样品溶液于96孔板中，加入190 μL ABTS工作液；空白管中加入10 μL水和190 μL ABTS工作液，对照管中加入10 μL不同质量浓度样品溶液和190 μL水，充分混匀，室温避光静置6 min，测定405 nm波长处的吸光度，计算ABTS自由基清除率。ABTS自由基清除率(D)=[A0-(A2-A1)]/A0×100%(2)式中：A1为10 μL样品溶液＋190 μL ABTS工作液的吸光度；A2为10 μL样品溶液＋190 μL水的吸光度；A0为10 μL水＋190 μL ABTS工作液的吸光度。1.2.2.3·O2-自由基清除能力采用·O2-自由基清除能力检测试剂盒检测连翘叶中7种成分的抗氧化活性。每种成分分别配制成0.125、0.250、0.500、0.800、1.000、1.500、2.000 g/L的样品溶液。取不同质量浓度样品溶液25 μL于96孔板中，加入200 μL超氧阴离子工作液，充分混匀，37 ℃显色20 min；以空白管调零，对照管中加入25 μL水和200 μL·O2-工作液，在530 nm处测定吸光度，计算·O2-自由基清除率。·O2-自由基清除率(I)=(A2-A1)/A2×100%(3)式中：A1为25 μL样品溶液＋200 μL超氧阴离子工作液的吸光度；A2为25 μL水样品溶液＋200 μL超氧阴离子工作液的吸光度。1.2.3受试样品对H2O2诱导巨噬细胞氧化损伤的保护作用1.2.3.1细胞培养RAW264.7巨噬细胞用RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、5%双抗）在恒温培养箱5% CO2、37 ℃条件下培养。1.2.3.2受试样品对巨噬细胞RAW264.7活性的影响将RAW264.7细胞按5×103个/孔接种于96孔板上，培养24 h，加入100 μL含不同水平样品的培养液，作用24 h，以换液的形式加入100 μL含10% CCK-8的培养液，孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm波长的OD值，以正常细胞为对照，计算细胞存活率。细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(4)式中：As为试验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、受试样品）的吸光度；Ab为对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8、不含受试样品）的吸光度；Ac为空白孔（不含细胞和受试样品的培养基、CCK-8）的吸光度。1.2.3.3H2O2诱导巨噬细胞RAW264.7氧化损伤模型的建立参照1.2.3.2方法，将加入不同水平受试样品溶液改为100、200、300、400、500、600、700 μmol/L H2O2溶液，计算细胞存活率。1.2.3.4受试样品对H2O2诱导的细胞活性的影响将RAW264.7细胞以4×103个/孔的密度接种于96孔板上，培养24 h，模型组加入300 μmol/L H2O2，试验组加入含不同水平受试样品的100 μL培养液，作用24 h；除空白对照组外，各孔弃去上清液加入300 μmol/L的H2O2诱导损伤，作用24 h，以换液的形式每孔加入100 μL含10% CCK-8的培养液，孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm波长的OD值，计算细胞存活率。1.2.3.5SOD、CAT、MDA和GSH的测定将RAW264.7细胞以5×105个/孔的密度接种在6孔板上，培养24 h，药物组加入100 μL含不同水平受试样品的培养液，阳性对照组以25 mg/L VC预处理，作用24 h；除空白对照组外，各孔弃去上清液加入300 μmol/L H2O2诱导损伤，处理24 h；去除上清液后以生理盐水清洗3遍，收集细胞。按照试剂盒说明书测定细胞内SOD、CAT活性以及MDA和GSH含量。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行初步处理，SPSS统计软件进行方差分析、主成分分析，Duncan's法进行多重比较。利用派森诺基因云网站（https://www.genescloud.cn/chart/chartOverview）进行热图分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1连翘叶中7种成分的体外抗氧化活性测定结果2.1.1翘叶中的7种成分的DPPH自由基清除率（见表1）由表1可知，随着各成分质量浓度增加，各成分对DPPH自由基的清除能力越强，且呈一定的剂量依赖性。连翘叶中7种成分对DPPH自由基的清除能力排序为FSBFSAFSIFSHPHGPINPHI，其中FSB的IC50值最小，清除能力最强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.T001表1连翘叶中7种成分的DPPH自由基的清除率组别DPPH自由基清除率/%IC50/(g/L)0.1 g/L0.2 g/L0.4 g/L0.6 g/L0.8 g/L1.0 g/L2.0 g/LPHI2.20±1.82e3.41±1.71f4.30±0.72f6.23±2.10f7.53±0.40g10.67±3.16e26.83±3.74d2.0PHG11.30±1.57d15.07±1.20e22.47±3.59e26.60±3.32e33.73±1.10f57.93±3.55c77.57±1.35c0.99PIN21.31±0.92c23.40±1.30d31.44±3.40d38.90±2.25d43.03±0.67e48.27±1.04d63.27±0.80b1.11FSA25.93±2.51b39.10±0.82b63.77±0.51b75.70±2.81c86.23±0.85c92.93±0.65b99.10±0.40a0.25FSB18.17±0.67c39.10±0.70b63.33±0.86b91.10±3.66b95.24±0.95b96.76±2.81ab98.92±0.80a0.24FSH19.32±0.53c31.30±0.60c57.80±2.46c78.17±0.90c81.63±1.70d92.90±0.85b98.23±0.60a0.29FSI21.34±2.60c36.80±1.39b63.72±2.55b76.63±3.41c82.57±0.95d93.33±1.12b98.63±1.14a0.26VC75.57±2.17a91.90±4.13a96.81±0.60a97.67±3.02a99.22±0.26a99.07±0.75a99.03±0.67a0.05注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。在质量浓度大于0.6 g/L时，FSB对DPPH自由基的清除率均高于其他成分。FSA、FSI、FSH对DPPH自由基也具有较好的清除能力，在同一质量浓度下，FSA、FSI、FSH对DPPH自由基清除率优于PHG、PIN、PHI，且在质量浓度为1.0 g/L时，FSA、FSI、FSH对DPPH自由基清除率均达到90%以上。2.1.2连翘叶中的7种单体成分对ABTS自由基的清除率（见表2）由表2可知，连翘叶中7种成分对ABTS自由基的清除作用随着各成分质量浓度的升高而增加，且呈剂量依赖性。连翘叶中7种成分对ABTS自由基的清除能力排序为FSIFSBFSAFSHPHGPINPHI。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.T002表2连翘叶中的7种单体成分对ABTS自由基的清除率组别ABTS自由基清除率/%IC50/(g/L)0.062 5 g/L0.125 0 g/L0.250 0 g/L0.500 0 g/L1.000 0 g/L1.500 0 g/L2.000 0 g/LPHI8.77±1.60e15.17±1.19g19.30±0.60f26.06±2.85e29.78±3.12d35.61±1.35d40.63±0.74c2.00PHG23.22±0.95c40.47±2.81e59.39±1.17d68.40±1.04d78.90±2.46c85.00±0.46c93.41±1.21b0.20PIN13.23±2.52d20.80±0.70f45.31±0.89e71.40±2.80c88.47±4.05b90.60±0.53b93.43±0.85b0.28FSA46.70±1.11b85.33±1.05b92.73±2.82b96.67±0.81ab99.13±0.32a97.73±3.07a98.87±0.76a0.06FSB61.51±0.75a73.60±1.28d90.43±2.99b95.30±0.89b98.50±1.01a99.31±0.82a99.23±0.29a0.05FSH46.77±2.25b81.17±3.08c99.40±1.00a99.41±0.40a99.47±0.45a98.50±1.06a98.60±1.20a0.06FSI60.00±2.80a80.97±1.25c87.47±0.55c95.50±1.17b97.53±1.10a98.70±0.56a98.37±1.12a0.04VC63.53±3.50a91.43±4.06a99.32±0.51a98.23±0.91ab98.50±1.18a99.03±0.60a99.45±0.46a0.04FSI的IC50值最小，为0.042 g/L，与VC基本相当（IC50值为0.039 g/L）。且在质量浓度大于1.0 g/L时，VC、FSA、FSB、FSH、FSI对ABTS自由基清除率均达到最大值，且各组间差异不显著（P0.05）。同一质量浓度下FSA、FSB、FSH、FSI对ABTS自由基清除率均显著高于PHI、PHG、PIN（P0.05）。2.1.3连翘叶中的7种单体成分对·O2-自由基的清除率（见表3）由表3可知，FSA、FSB、FSH、FSI对·O2-自由基的清除作用存在剂量依赖关系，在0.125~2.000 g/L的质量浓度范围内，随着各成分质量浓度的增加，超氧阴离子自由基清除率增加。连翘叶中7种成分对·O2-自由基的清除能力排序为FSHFSIFSBFSAPHI=PHG=PIN，其中FSH对·O2-自由基清除效果最好，IC50值为0.32 g/L。FSA、FSB、FSI对·O2-自由基也具有较好的清除能力，而PHG、PIN、PHI对·O2-自由基清除能力较弱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.T003表3连翘叶中的7种单体成分对·O2-自由基的清除率组别·O2-自由基清除率/%IC50/(g/L)0.125 g/L0.250 g/L0.500 g/L0.800 g/L1.000 g/L1.500 g/L2.000 g/LPHI18.90±2.32f20.40±2.58f20.62±3.25f21.53±1.51g25.67±1.25e27.71±2.01f27.80±2.93g2.00PHG18.41±2.28f18.90±1.46f20.83±1.49f21.40±1.87g25.53±1.10e35.70±1.20e41.57±0.75e2.00PIN19.97±1.77f24.67±1.85e28.17±1.72e33.53±2.15f35.55±1.84d38.77±2.85e37.67±1.90f2.00FSA25.07±1.78e17.75±3.50f37.90±0.96d38.46±1.78e66.45±1.80c73.33±2.80c77.00±1.60c0.71FSB31.04±1.74d43.83±3.67b42.23±2.92c44.21±1.31d63.64±1.74c66.33±0.93d66.80±1.25d0.58FSH46.13±0.58b38.89±1.61c45.74±1.20b57.70±0.92c75.33±2.02b78.93±1.88b85.47±1.17b0.32FSI42.57±0.95c34.07±0.38d34.81±1.00d67.60±1.33b76.63±0.85b79.50±0.87b82.70±1.50b0.37VC56.10±1.35a68.05±1.32a79.23±1.56a85.33±3.02a89.06±1.95a93.20±2.51a96.02±1.54a0.112.2连翘叶7种成分对H2O2诱导巨噬细胞RAW264.7氧化损伤的保护作用2.2.1连翘叶7种成分对巨噬细胞RAW264.7存活率的影响（见图1）由图1可知，PHI、PHG质量浓度为5~20 μmol/L时，PIN、FSA、FSB、FSH、FSI质量浓度为5~40 μmol/L浓度时，细胞存活率高于90%；在质量浓度超过80 μmol/L时，各物质的细胞活力均受到不同程度的影响。因此，PHI、PHG选择质量浓度为20 μmol/L，PIN、FSA、FSB、FSH、FSI选择质量浓度为40 μmol/L进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.F001图1连翘叶中7种成分对巨噬细胞RAW264.7存活率的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下同。2.2.2H2O2诱导氧化损伤对RAW264.7细胞存活率的影响（见图2）由图2可知，以300 μmol/L H2O2损伤时，细胞的存活率为60.78%，符合氧化损伤模型标准（50%~70%细胞存活率）。选择H2O2质量浓度为300 μmol/L进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.F002图2H2O2诱导氧化损伤对RAW264.7细胞存活率的影响2.2.3连翘叶中7种单体成分对对H2O2诱导氧化损伤RAW264.7细胞存活率的影响（见图3）由图3可知，与空白对照组相比，H2O2刺激细胞后，细胞存活率为（56.60±4.77）%。与模型对照组相比，FSA、FSB、FSI可提高细胞存活率，FSH、PHG、PHI次之，PIN最弱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.F003图3连翘叶中7种单体成分对对H2O2诱导氧化损伤RAW264.7细胞存活率的影响2.2.4连翘叶中7种单体成分对巨噬细胞RAW264.7抗氧化能力的影响（见图4）由图4可知，与空白对照组相比，模型对照组细胞中SOD、CAT活性及GSH含量显著降低（P0.05），MDA含量显著升高（P0.05），表明H2O2诱导RAW264.7巨噬细胞造成了细胞的氧化损伤。与模型对照组相比，除PHG、PIN外，其余5种成分均提高了H2O2诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞内SOD活性，表现为FSBFSAFSIPHIFSH。除PHI、PIN外，其余5种成分均提高了细胞内CAT的活性，表现为FSAFSIFSBFSHPHG；除PHI、PIN外，其余5种成分均抑制了细胞中GSH含量下降，表现为FSAFSHFSBFSIPHG；除PIN外，其余6种成分降低了细胞中MDA含量，表现为FSAFSHFSIFSBPHGPHI。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.F004图4连翘叶中7种单体成分对氧化损伤细胞抗氧化能力的影响2.3连翘叶中7种成分抗氧化活性的热图分析（见图5）由图5可知，成分FSA、FSB、FSH和FSI的抗氧化活性较为接近，其抗氧化酶SOD、CAT活性及GSH含量比较高，并且MDA含量、DPPH自由基、ABTS自由基、·O2-自由基清除率IC50值较低；成分PHI、PHG和PIN对抗氧化酶活性较弱，MDA含量、DPPH自由基、ABTS自由基、·O2-自由基清除率IC50值较高。因此，FSA、FSB、FSH和FSI表现出较高的抗氧化活性；PHI、PHG和PIN抗氧化活性较弱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.F005图5连翘叶中7种单体成分抗氧化活性的热图分析2.4连翘叶中7种成分抗氧化活性的主成分分析（见图6）由图6可知，PC1、PC2累积贡献率达89.6%，7种成分可聚为两类，其中第一类聚集了FSA、FSB、FSH和FSI，第二类聚集了PHI、PHG和PIN。抗氧化活性较好的成分均聚集在第一类，表明抗氧化能力和FSA等4种苯乙醇苷类成分之间呈正相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.019.F006图6连翘叶中7种单体成分抗氧化活性的主成分分析3讨论苯乙醇苷类和木脂素类化合物均为连翘叶中的主要成分[16]。Yuan等[17]以连翘叶为原料，经有机试剂提取、乙醇沉淀和柱层析分离得到粗PHI、精制PHI、粗FSA和精制FSA，发现FSA具有较强的清除DPPH自由基的能力，清除·OH自由基、·O2-自由基和总抗氧化能力均优于2,6-二叔丁基对甲酚（BHT），但不及VC。研究发现，PHI对3种动物油脂均具有良好的抗氧化作用[18]，但效果不及FSA[19]。刘金等[20]以小牛胸腺DNA为体外模型研究FSA对自由基的清除效果，结果发现，FSA对·OH自由基引发的DNA损伤具有保护作用。秦宇等[21]发现，与2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）相比，FSA清除DPPH自由基的效果更佳。结果表明，FSA的抗氧化活性使之成为天然的抗氧化剂，但均无对连翘叶中以连翘酯苷为代表的苯乙醇苷类成分和连翘苷为代表的木脂素类成分系统地进行抗氧化活性研究。本试验热图分析表明，FSA、FSB、FSH、FSI等4种苯乙醇苷类成分能够显著提高细胞内抗氧化酶（SOD、CAT）的活性和GSH含量，显著降低MDA含量，有效清除DPPH自由基、ABTS自由基、·O2-自由基，特别是对ABTS自由基表现出良好的抗氧化活性。而PHI、PHG、PIN 3种木脂素类成分不能够显著提高细胞内抗氧化酶活力，表现出较弱的氧化损伤保护作用。主成分分析结果表明，FSA、FSB、FSH、FSI等4种苯乙醇苷类成分之间明显存在聚类，PHI、PHG、PIN等3种木脂素类成分之间也存在明显聚类，抗氧化活性较好的成分均聚集在苯乙醇苷类成分之间，抗氧化能力和FSA 4种苯乙醇苷类成分之间呈正相关。4结论本试验发现，FSA等4种苯乙醇苷类成分的抗氧化活性明显优于PHI等3种木脂素类成分，表明苯乙醇苷类成分应该是连翘叶发挥抗氧化活性的主要药效物质基础。