我国农作物秸秆的产量高，各类农作物秸秆的年均总量可达8.65亿t[1]。秸秆纤维素作为一种有机碳水化合物，是农作物秸秆的主要成分[2]。农作物秸秆的综合化利用，如肥料化、饲料化、能源化、基料化和原料化等，备受关注[3]。秸秆饲料化是利用活菌制剂或生物酶制剂将难以利用的纤维素大分子分解为小分子多糖，并通过菌体生物量的增长提高饲料的蛋白含量[4]。秸秆类饲料作为粗饲料资源，可有效弥补畜牧业饲料的短缺，支撑草食畜牧业的可持续发展[5]。毛婷等[6]研究发现，利用产纤维素酶菌株进行混合发酵降解秸秆纤维素，提升其饲用价值。王啸林等[7]研究发现，使用乳酸菌和纤维素酶混合青贮发酵马铃薯渣和玉米秸秆能够改善其营养品质和发酵品质。但目前已发现的秸秆纤维素降解菌株普遍存在诱导产酶时间长、酶活性较低、纯化困难等问题[8]。本研究以玉米秸秆粉为唯一碳源，从土壤中筛选秸秆纤维素高效降解菌株，并克隆其内切葡聚糖酶基因，构建异源表达系统，旨在为秸秆类饲料发酵菌剂新品种的开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验样品土壤样品使用“五点采样法”采自河北省深州市（38N115E）玉米秸秆堆砌农田。1.1.2培养基富集培养基：(NH4)2SO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO4 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、玉米秸秆粉5 g/L，pH值5.5~6.0，121 ℃高温灭菌20 min。筛选培养基：(NH4)2SO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO4 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5 g/L、琼脂粉18 g/L，pH值5.5~6.0，121 ℃高温灭菌20 min。发酵培养基：蛋白胨5.0 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO4 1 g/L、NaCl 0.5g/L、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5 g/L，pH值5.5~6.0，121 ℃高温灭菌20 min。1.1.3菌株、质粒和试剂大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和BL21（DE3）、pCold Ⅰ表达载体由本实验室保存；pEASY-T1 Cloning Kit购自北京全式金公司。刚果红、CMC-Na购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白胨购自生工生物工程（上海）股份有限公司；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。1.2测定指标及方法1.2.1秸秆纤维素降解菌株的富集和筛选富集：称取1 g样品，置于50 mL富集培养基中，30 ℃、120 r/min培养2~3 d。每隔72 h传代1次，传代3次后涂布分离。初筛：吸取1 mL富集培养液梯度稀释至10-7，选取10-3、10-5、10-7稀释液涂布筛选培养基平板，30 ℃培养48 h。挑取单菌落接入0.5 mL发酵培养基，挑菌后的平板进行刚果红染色初筛，测量透明圈直径和菌落直径，选取两者比值的单菌落进行复筛。复筛：将初筛菌株接入2 mL发酵培养基中，30 ℃、200 r/min培养48 h，12 000 r/min离心2 min，上清液即为粗酶液。取粗酶液进行纤维素酶酶活测定，选取酶活最高的菌株作为目的菌株进行后续试验。1.2.2纤维素酶酶活酶活采用3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）法[9]测定，向试管中加入1% CMC-Na/乙酸-乙酸钠缓冲液（100 mmol/L，pH值5.0）0.5 mL、粗酶液0.5 mL，于37 °C水浴中反应10 min，取出，加入3.0 mL DNS终止反应，沸水浴5 min，冷却，540 nm处测量吸光值。根据葡萄糖标准曲线回归方程，计算还原糖质量浓度。酶活力单位（U）定义为：在上述条件下每分钟催化底物生成1 μmol还原糖所需酶量为1个活力单位。1.2.3菌株鉴定形态学和生理生化鉴定：目的菌株平板划线培养后观察其菌落形态，挑取单菌落涂片进行革兰氏染色，使用光学显微镜观察、记录菌体形态。通过细菌微量生化鉴定管，参照《常见细菌系统鉴定手册》进行目的菌株的生理生化鉴定。16S rDNA鉴定：使用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取目的菌株基因组DNA，并以其为模板，利用通用引物27F/1492R扩增目的菌株16S rDNA序列，扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果经拼接去杂后进行Blast序列比对，选取高相似性模式菌株序列，利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统发育树。1.2.4菌株粗酶液酶学性质研究1.2.4.1酶反应的最适温度和温度稳定性最适反应温度：将1%的底物溶液与粗酶液混合，分别在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃条件下，反应10 min，DNS法测定酶活。每个温度条件设置两个平行，取均值确定酶的最适反应温度，并将最高酶活记为100%，用于计算其他温度的相对酶活。相对酶活=处理酶活/最高酶活×100%(1)温度稳定性：使用乙酸-乙酸钠缓冲液体系（100 mmol/L，pH值5.0）作为反应体系，将粗酶液分别置于40、45、50、55、60、65、70 ℃下保温1 h，测定酶活，计算相对酶活。1.2.4.2酶反应的最适pH值和pH值稳定性最适反应pH值：所用缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液体系（pH值4.0、5.0），Tris-HCl（pH值6.0~10.0）。粗酶液分别与pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0缓冲剂的底物溶液混合，55 ℃条件下反应10 min，DNS法测定酶活。每个pH值条件设置2个平行，取均值确定酶的最适反应pH值，并将最高酶活记为100%，用于计算其他pH值的相对酶活。pH值稳定性：将酶液保存于不同pH值的缓冲液中，于4 ℃中放置2 h，在最适pH值和最适温度下测定酶活，以最高酶活记为100%，计算相对酶活。1.2.5内切葡聚糖酶基因的克隆与表达扩增：根据菌株鉴定结果和NCBI已登录的芽孢杆菌属β-1,4-endoglucanase基因序列（登录号：DQ782954, KY797654, AY766381），使用Primer Premier 7.0软件设计1对特异性引物，序列如下：YB-F：CCGGATCCA TGAAACGGTCAATCTCTA（下划线为BamH I酶切位点）；YB-R：CGAAGCTTCTAATTTGGTTC TGTTC CCCA（下划线为Hind Ⅲ酶切位点）。以目的菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段。将回收后的内切葡聚糖酶基因命名为eg20SJ。克隆：使用pEASY-T1克隆试剂盒，通过TA克隆方法，将胶回收产物与T载体连接，构建重组质粒pEASY-T1-eg20SJ。连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，利用蓝白斑筛选鉴定阳性克隆，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。表达：将克隆质粒pEASY-T1-eg20SJ使用Hind Ⅲ和BamH I进行双酶切，切胶回收目的基因eg20SJ并连入pCold I，构建含内切葡聚糖酶基因的表达载体pCold I-eg20SJ。将pCold I-eg20SJ转化大肠杆菌BL21（DE3），构建表达菌株。挑取pCold I-eg20SJ- BL21（DE3）单菌落制备种子液，并以2%接种量放大培养，培养至OD600 nm达到0.6，冷却培养液至16 ℃，放置30 min，加入IPTG至0.5 mmol/L，16 ℃、200 r/min振荡培养24 h。SDS-PAGE电泳检测表达菌株细胞内重组内切葡聚糖酶的过表达情况。离心收获菌体，超声破碎获得粗酶液，按1.2.2的方法测定酶活。1.3数据统计与分析试验数据采用Graph Prism 7.0软件进行方差分析，绘制折线图。2结果与分析2.1秸秆纤维素降解菌株的筛选结果经刚果红染色法多轮筛选，并结合DNS法复筛，从堆砌秸秆的土壤中获得一株高活性的秸秆纤维素降解菌株，将其命名为HSU-20SJ。菌株HSU-20SJ纤维素水解透明圈见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.F001图1菌株HSU-20SJ纤维素水解透明圈由图1可知，该菌株具有明显的纤维素水解透明圈，与菌落直径比值可达5.5，内切葡聚糖酶酶活为3.23 U/mL。2.2菌株HSU-20SJ鉴定结果2.2.1菌株形态观察结果（见图2、图3）由图2可知，菌株HSU-20SJ的菌落近圆形，表面湿润，无光泽且不透明，灰白色，边缘较规则。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.F002图2菌株HSU-20SJ的菌落形态由图3可知，菌株HSU-20SJ革兰氏染色呈阳性，显微镜观察显示其菌体杆状，粗且短，末端圆。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.F003图3菌株HSU-20SJ革兰氏染色菌体形态2.2.2菌株HSU-20SJ的生理生化特性结果（见表1）由表1可知，结合《伯杰细菌鉴定手册》，将菌株HSU-20SJ初步鉴定为芽孢杆菌属细菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.T001表1菌株HSU-20SJ的生理生化特性结果项目淀粉水解明胶液化柠檬酸盐石蕊牛奶V-P氧化酶接触酶尿素糖发酵吲哚试验结果+++++++-+-注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。2.2.316S rDNA鉴定和系统发育树分析（见图4）经通用引物27F/1492R扩增后的16S rDNA序列测序拼接后，输入NCBI数据库进行Blast比对，发现菌株与Bacillus velezensis CBMB205（登录号：NR_116240.1）的序列相似性为99%。由图4可知，菌株HSU-20SJ与贝莱斯芽孢杆菌聚类为一支，两者亲缘关系最近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.F004图416S rDNA的菌株HSU-20SJ系统发育树2.3菌株HSU-20SJ粗酶液的最适反应温度与pH值（见图5）由图5（a）可知，菌株HSU-20SJ粗酶液的最适反应温度为55 ℃，在反应温度为40~55 ℃时，该酶相对酶活均大于85%；温度为40~50 ℃的区间稳定性好，相对酶活均大于85%，60 ℃之后稳定性迅速下降，70 ℃时降至38.8%，表明该酶适用于中温反应。由图5（b）可知，菌株HSU-20SJ粗酶液的最适反应pH值为5.0，pH值大于8.0时，酶活力快速下降；在pH值4.0~9.0范围内，相对酶活保持在70%以上，表明该酶pH值耐受性范围较广。图5菌株HSU-20SJ粗酶液的最适反应温度与pH值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.F5a1（a）最适反应温度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.F5a2（b）最适pH值2.4内切葡聚糖酶基因的克隆与表达结果（见图6、图7）由图6可知，以贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HSU-20SJ基因组DNA为模板，经PCR扩增后得到的产物，在琼脂糖凝胶的约1 500 bp处有明显条带，与预期的目的基因大小相符。PCR产物经TA克隆、测序和拼接后，选用带有冷休克基因cspA启动子的pCold I构建表达载体pCold I-eg20SJ，该载体经双酶切验证，得到约1 500 bp大小的条带。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.F006图6基因eg20SJ的PCR产物和重组表达载体pCold I-eg20SJ的双酶切凝胶电泳结果注：M为DNA marker DL2000，图（a）中1为基因eg20SJ的PCR产物；图（b）中1、2、3为pCold I-eg20SJ的双酶切产物。将pCold I-eg20SJ转入大肠杆菌BL21（DE3）形成异源表达菌株。经16 ℃诱导24 h，收集菌体进行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），结果见图7。由图7可知，经IPTG诱导的pCold I-eg20SJ /BL21（DE3）菌株在凝胶上均出现了分子量约为55 kDa的蛋白条带，与理论分子量相一致。菌体超声破碎、离心，获得的含重组内切葡聚糖酶的粗酶液酶活为6.28 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.018.F007图7SDS-PAGE检测重组内切葡聚糖酶的诱导表达结果注：M为Ture Color protein marker；CK为未加诱导剂；1、2、3为加诱导剂。3讨论农作物秸秆饲料化加工技术主要包括微贮、青贮和酶解处理[10]，其中微贮和青贮均需要将收集的农作物秸秆与单一菌剂或复合菌剂[11]按比例混合后进行发酵处理，利用微生物自身酶系降解秸秆纤维素、半纤维素和木质素等难消化物质，使之成为柔软多汁、适口性好的粗饲料。芽孢杆菌产酶丰富，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶，且均为胞外酶，已作为安全无害的菌剂[12]广泛用于秸秆类饲料的发酵生产中[13-16]。本研究以玉米秸秆粉为唯一碳源，经刚果红法初筛、DNS法复筛，获得一株高产纤维素酶的菌株HSU-20SJ，该菌株通过形态学观察、生理生化试验和分子生物学鉴定，被确定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。该菌为芽孢菌属的一个新种，酶系丰富、产酶能力强、抗逆性和抗菌能力高，广泛应用于饲料、养殖等农业生产过程[17]。秸秆类饲料发酵时通常会使用乳酸菌将纤维素分解后的糖分转化为乳酸，利用低pH值抑制杂菌生长，使饲料长期保存并保持口感[18]。王巍杰等[19]以玉米秸秆为原料，使用乳酸菌和枯草芽孢杆菌混合发酵降解秸秆纤维素，使糖化率增加、饲料适口性和利用率提高。本研究获得的贝莱斯芽孢杆菌HSU-20SJ，经多轮低pH值培养基富集筛选，耐酸性稳定，且该菌株产生的胞外纤维素酶的最适反应pH值为5.0，在pH值为4.0~9.0条件下，相对酶活保持在70%以上，表明该菌株具备与乳酸菌形成秸秆类饲料发酵复合菌剂的潜力。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[20]。内切葡聚糖酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，通过水解长链纤维素分子的β-1,4-糖苷键，生成小分子纤维素益生元，促进动物肠道益生菌生长[21]。近年来，纤维素酶与菌剂混合协同发酵秸秆类饲料成为研究热点。谢全喜等[22]研究发现，使用复合益生菌和纤维素酶混合发酵小麦秸秆能够显著提升其发酵品质和营养价值。刘辉等[23]研究发现，采用布氏乳杆菌和纤维素酶生产青贮玉米秸秆类饲料可提高饲料品质和有氧稳定性。但天然来源的纤维素酶产量低，纯化困难，难以满足大规模应用。纤维素酶的异源表达可以提高其生产效率，已被广泛探究。闫建英等[24]从绿色木霉中克隆到内切葡聚糖酶基因EG Ⅶ，并在枯草芽孢杆菌中实现了表达。谢骜李畅等[25]从桑天牛肠道中分离到枯草芽孢杆菌并克隆到内切葡聚糖酶基因，在乳酸菌中实现了表达。本研究从贝莱斯芽孢杆菌HSU-20SJ中克隆到内切葡聚糖酶基因eg20SJ，并在大肠杆菌中实现了异源表达，重组内切葡聚糖酶的酶活力为6.28 U/mL，与原始菌株相比酶活力提高了近1倍。4结论本研究成功筛选得到1株耐酸的产纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌HSU-20SJ，该菌株所产纤维素酶的最适反应pH值为5.0，pH值4.0~9.0稳定性好，具有一定的耐酸性。从菌株HSU-20SJ基因组DNA中克隆得到内切葡聚糖酶基因，构建了大肠杆菌异源表达系统，可以为后续的规模化生产和应用提供参考。