家禽胃肠道微生物群会影响宿主的生理、营养状况及其在应激条件下的行为[1]。肠道微生物以发酵终产物的形式向宿主提供代谢物和其他分泌产物，如脂类、碳水化合物、有机酸、氨基酸等营养物质，从而满足宿主对营养和能量的需求[2]。由于抗生素会使细菌产生耐药性，造成药物残留，我国已禁止在饲料中添加抗生素[3]。辣木是一种具有牧草潜力的热带灌木，在热带和亚热带地区广泛分布[4-5]。辣木具有很高的营养价值，具有抗炎、抗氧化、抑菌[6]、降脂、抗菌杀虫、抗氧化等多种功能[7]。研究表明，辣木叶含有丰富的营养成分和具有抗生素特性，且抗营养成分较少，可以有效地对抗营养不良[8]，不会引起畜禽中毒反应[9]，是改善肉类品质和调节肠道健康的潜在宝贵资源[10]。本试验旨在研究日粮中添加辣木叶粉对茶花鸡器官发育、肠道发育和盲肠微生物区系的影响，为辣木叶粉在改善家禽肠道健康、促进肠道发育方面提供参考。1材料与方法1.1试验设计选取1日龄茶花鸡（母鸡）450只，随机分为5组，每组6个重复，每个重复15只鸡。对照1组（CK1组）茶花鸡饲喂基础日粮，对照2组（CK2组）茶花鸡饲喂商品日粮，MOLP5组、MOLP15组、MOLP20组分别在基础日粮中添加5%、15%、20%辣木叶粉，基础日粮配方参照NRC（1994）和《动物营养参数与饲养标准》家禽营养需要配制粉状配合饲料，试验日粮组成及营养水平见表1。商品日粮由石家庄正大饲料有限公司提供，其中粗蛋白19.00%，钙0.6%~1.2%，总磷0.40%，氯化钠0.2%~0.8%。试验期63 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）项目CK1组MOLP5组MOLP15组MOLP20组原料组成/%玉米64.6361.8755.6552.73豆粕25.9324.1020.8019.30鱼粉3.433.653.954.01豆油2.171.811.331.00辣木叶粉05.0015.0020.00赖氨酸（98%）0.050.050.080.13蛋氨酸（98%）0.180.180.180.18石粉1.060.900.860.50磷酸氢钙1.301.190.900.90食盐0.250.250.250.25预混料1.001.001.001.00合计100.00100.00100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.5412.5412.5412.54粗蛋白质/%19.0019.0019.0019.00粗纤维/%2.583.826.307.55赖氨酸/%1.081.030.980.98蛋氨酸/%0.500.490.470.45钙/%0.900.911.000.99有效磷/%0.450.460.470.46注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 15 000 IU、VB1 2 mg、VB2（核黄素）8 mg、泛酸10 mg、VB6 3.5 mg、VB120.08 mg、VD3 2750 IU、VE 62.50 IU、VK3 8 mg、生物素0.18 mg、叶酸2.0 mg、烟酸35 mg、铜9 mg、铁80 mg、锰100 mg、锌80 mg、碘0.35 mg、硒0.30 mg。2.营养水平均为计算值。1.2饲养管理茶花鸡在4层立体鸡舍圈养，试验期间自由采食和饮水，每天记录采食量及鸡的死淘情况。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能每天记录各组茶花鸡的采食量，测定各组茶花鸡的初重和末重，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=耗料量/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.2器官发育指标试验最后1 d，选取12只鸡屠宰，取鸡的心脏、肝脏、脾脏等，称量各器官的重量，计算脏器指数。脏器指数=各器官重(g)/活体重(kg)×100(4)1.3.3肠道发育指标屠宰后保留鸡的肠道，分离出肌胃、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠，称量各肠道的重量，计算各肠道指数。肠道指数=各肠道重(g)/活体重(kg)×100(5)1.3.4盲肠微生物多样性屠宰后，每组分别采集6只茶花鸡的盲肠食糜，打开肉鸡腹腔，使用75%乙醇对盲肠外壁进行消毒，取1 g左右的盲肠食糜置于灭菌冻存管中，于液氮内保存，待取样结束后转移到-80 ℃超低温冰箱中保存，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行16S rDNA测序。基于Illumina NovaSeq测序平台对V3~V4高变区进行双末端测序，以分析盲肠菌群多样性。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 23.0软件中的One-way ANOVA进行统计分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1辣木叶粉对茶花鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，MOLP5组茶花鸡平均日增重高于MOLP15组和MOLP20组（P0.05），CK2组茶花鸡的平均日采食量明显高于其余各组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.T002表2辣木叶粉对茶花鸡生长性能的影响组别初重/g3周龄体重/g6周龄体重/g9周龄体重/g平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]料重比CK1组33.05±2.88168.19±10.69b386.79±20.80b730.43±60.81b11.07±0.97b36.63±5.58b3.31±0.50MOLP5组32.49±2.43146.52±11.54c367.01±28.91c696.50±63.29c10.54±1.00b34.06±4.85b3.23±0.46MOLP15组31.81±2.24135.57±11.77d282.44±37.65d593.92±58.06d8.92±0.92c32.59±8.18b3.65±0.92MOLP20组30.29±1.58122.69±12.14e222.44±29.14e504.94±76.75e7.53±1.22d27.80±3.11b3.69±0.41CK2组31.11±1.28219.03±15.03a585.31±43.81a996.92±73.69a15.33±1.17a51.33±9.04a3.35±0.59注：同列数据不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2辣木叶粉对茶花鸡器官发育的影响（见表3）由表3可知，MOLP5组茶花鸡的胰脏、心脏、肝脏、脾脏指数与对照组相比具有升高的趋势。研究表明，添加5%辣木叶粉对茶花鸡的器官无不良影响，且可以提高器官指数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.T003表3辣木叶粉对茶花鸡器官发育的影响项目组别法氏囊胸腺胰腺心脏肝脏脾脏器官质量/gCK1组0.77±0.43ab6.18±1.21a2.20±0.23bc4.33±0.81b16.54±1.07b1.69±0.67bMOLP5组1.54±0.59a6.10±1.63a2.13±0.44bc4.27±0.63b16.67±2.35b1.80±0.39bMOLP15组1.30±0.83ab4.23±1.21b2.37±0.32b4.22±1.19b16.50±2.85b1.79±1.01bMOLP20组0.69±0.25b2.37±0.72c1.84±0.30c2.91±0.57c13.20±2.37c1.09±0.50bCK2组1.10±0.79ab3.03±0.83bc3.13±0.53a6.20±1.19a21.43±2.66a4.27±0.34a器官指数/(g/kg)CK1组0.95±0.597.55±1.83a2.64±0.26bc5.19±0.92ab19.88±1.41b2.01±0.74bMOLP5组1.43±0.738.03±1.99a2.83±0.51b5.70±0.89ab22.04±0.75ab2.41±0.65abMOLP15组1.25±0.336.24±1.41a3.50±0.35a6.21±1.65a24.38±3.44a2.31±1.01abMOLP20组1.13±0.424.34±1.13b3.38±0.52a5.33±0.96ab24.09±3.12a1.93±0.73bCK2组0.78±0.582.21±0.78c2.26±0.55c4.40±0.45b15.48±3.17c3.04±0.12a2.3辣木叶粉对茶花鸡肠道发育的影响（见表4）由表4可知，各试验组茶花鸡的腺胃指数、肌胃指数、十二指肠指数、空肠指数、回肠指数、盲肠指数均显著高于CK2组（P0.05）。MOLP5组茶花鸡的十二指肠指数显著高于CK1组和CK2组（P0.05），MOLP15组茶花鸡的空肠指数、回肠指数显著高于CK1组和CK2组（P0.05），MOLP20组茶花鸡的肌胃指数、空肠指数、回肠指数、盲肠指数显著高于CK1组和CK2组（P0.05）。研究表明，在日粮中添加辣木叶粉可促进茶花鸡的肠道发育。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.T004表4辣木叶粉对茶花鸡肠道发育的影响项目组别腺胃肌胃十二指肠空肠回肠盲肠直肠肠道重量/gCK1组4.41±0.73a19.55±2.466.15±0.74ab9.55±1.71ab6.88±0.91b5.03±0.61ab3.39±0.32bMOLP5组3.87±0.58ab19.12±2.556.87±1.42a9.36±1.09ab6.74±1.13b4.21±1.09b2.55±0.46bMOLP15组3.83±0.30ab18.38±2.625.86±0.77ab10.02±1.78ab7.73±1.67b4.43±0.45b2.49±1.16bMOLP20组3.51±0.57b17.92±2.774.73±1.18b8.64±1.65b6.33±0.61b3.99±0.66b1.35±0.21cCK2组4.18±0.28a15.62±3.086.33±0.86ab11.15±0.66a9.82±1.13a5.63±0.59a7.06±1.29a肠道指数/(g/kg)CK1组5.28±0.81a23.52±3.15b7.29±0.50b11.28±1.48c8.19±1.11cd5.96±0.32b4.03±0.40abMOLP5组5.13±0.80a26.09±3.95ab9.81±1.95a13.35±1.12bc9.61±1.36bc5.99±1.46b3.69±0.86abMOLP15组5.69±0.55a27.33±4.18ab8.92±1.05ab15.30±3.04ab11.69±2.14ab6.75±0.68ab3.76±1.72abMOLP20组6.02±1.13a28.66±2.38a9.30±2.53ab16.76±2.74a12.36±1.47a7.81±1.46a2.74±0.95bCK2组3.00±0.37b11.32±3.05c4.58±0.99c7.97±0.51d7.01±0.74d4.01±0.03c5.07±1.09a2.4辣木叶粉对茶花鸡肠道微生物多样性的影响2.4.1辣木叶粉对茶花鸡Alpha多样性指数的影响（见表5）由表5可知，MOLP5组的Alpha多样性指数均高于其余各组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.T005表5辣木叶粉对茶花鸡Alpha多样性指数的影响组别observed_species指数Shannon指数Simpson指数Chao1指数Ace指数CK1组699.17±109.98bc6.43±0.33a0.97±0.01a744.59±116.07ab749.30±115.31abMOLP5组797.50±32.02a6.35±0.23a0.96±0.01ab836.51±36.41a844.57±36.26aMOLP15组633.17±95.45c5.49±0.49b0.92±0.04bc668.35±107.17b677.26±104.81bMOLP20组750.33±40.12ab5.61±0.70b0.89±0.06c794.88±35.95a801.43±36.92aCK2组634.50±69.82c5.48±0.22b0.93±0.01ab681.08±71.39b688.59±71.17b2.4.2辣木叶粉对茶花鸡肠道β多样性的影响（见图1）由图1可知，MOLP5组和CK1组样本较集中且距离较近，表明其物种相似度差异较小；CK2组、MOLP15组和MOLP20组样本较分散，且样本距离相对较远，表明其物种存在较大差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.F001图1距离PCoA分析结果2.4.3OTUs数量分析结果（见图2）由图2可知，5组共有705个OTUs相同，CK1组、MOLP5组、MOLP15组、MOLP20组和CK2组各有133、119、76、108和104个独有的OTUs。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.F002图2OTUs数量分析2.4.4辣木叶粉对茶花鸡盲肠门水平上的物种相对丰度的影响（见图3）由图3可知，由每个分组在门水平上最大丰度排名前10的物种组成可知，拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、螺旋体门（Spirochaetota）、弯曲杆菌门（Campylobacterota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）是主要菌门，添加辣木叶粉后拟杆菌门、厚壁菌门、螺旋体门丰度有所增加，弯曲杆菌门、脱硫杆菌门、疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰度明显降低，其中MOLP15组的螺旋体门和脱铁杆菌门（Deferribacteres）丰度明显增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.F003图3辣木叶粉对茶花鸡盲肠门水平上的物种相对丰度的影响2.4.5辣木叶粉对茶花鸡盲肠属水平上的物种相对丰度的影响（见图4）由图4可知，理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）和拟杆菌属（Bacteroides）所占比例最高，MOLP5组的另枝菌属（Alistipes）的所占比例高于其余各组，CK1组和CK2组所占比例较低，MOLP15组的Sphaerochaeta、Mucispirillum所占比例高于其余各组，MOLP20组的粪栖杆菌属（Faecalibacterium）所占比例高于其余各组，各试验组的Akkermansia均高于CK1组。研究表明，添加辣木叶粉增加了茶花鸡肠道有益菌的定植，减少了有害菌的数量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.F004图4辣木叶粉对茶花鸡盲肠属水平上的物种相对丰度的影响2.4.6辣木叶粉对茶花鸡肠道微生物LEfSe分析结果的影响（见图5）由图5可知，CK1组的核心菌群主要是弯曲菌科（Campylobacteraceae）、芽孢杆菌纲（Bacilli），MOLP5组的核心菌群主要是毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、毛螺旋菌目（Lachnospirales）、梭菌纲（Clostridia），MOLP15组的核心菌群主要是脱铁杆菌科（Deferribacteraceae）、脱铁杆菌目（Deferribacterales）、未命名脱铁杆菌纲（Unidendified-Deferribacte），MOLP20组的核心菌群主要是理研菌科（Rikenellaceae）、梭菌目-UCG-014（Clostridia-UCG-014）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、颤藻目（Oscillatoriales），CK2组的核心菌群主要是拟杆菌科（Bacteroidaceae）、坦纳菌属（Tannerellaceae）、Negativicutes纲。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.02.012.F005图5线型判别分析（LDA）进化分枝图3讨论3.1辣木叶粉对茶花鸡生长性能的影响研究表明，在日粮中添加少量辣木叶或替代基础日粮不会影响家禽的生长性能[11]。孙士文[12]研究表明，日粮中添加8%的辣木叶对肉鸡生长性能无明显影响，但添加量达10%时，会降低肉鸡的平均日采食量和平均日增重。本试验发现，当辣木叶粉添加量为15%和20%时，降低了茶花鸡的体重以及采食量，可能是因为辣木叶中抗氧化物质单宁的存在导致茶花鸡的采食量等下降，降低了其生长速度，当辣木叶替代量增加，粗纤维含量相对增加，进而影响日粮口感。3.2辣木叶粉对茶花鸡器官及肠道发育的影响肠道的基本功能是为生物体提供维持生命所需的水和营养物质，消化道的发育情况和健康情况会直接影响家禽的生长，良好的小肠形态是营养物质被消化与吸收的关键。小肠长度及重量变化均可引起小肠对营养物质吸收的改变，从而影响动物的生长性能[13]。健康动物的器官指数相对稳定，器官指数变化能够反映器官充血、增生或萎缩及退行性变化等[14]。刘娇等[15]在肉鸡日粮中添加0.75 g/kg和10.00 g/kg的辣木提取物，对42日龄肉鸡的消化器官和免疫器官指数的作用效果均不显著。Dahouda等[16]分别以0、8%、16%和24%的辣木叶粉替代花生饼粉饲喂肉鸡，结果发现，除添加16%辣木叶粉组肉鸡的脾+肺重量显著高于对照组外，其余各组心和肝脏等内脏器官重量与对照组均无显著差异。Zanu等[17]研究发现，添加5%、10%和15%辣木叶粉对肉鸡的心、肾、肝脏重量以及嗉囊、腺胃和小肠重量均无显著影响。本试验中，日粮中加入不同比例的辣木叶粉，各组间的肌胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠重量差异不显著，CK1组、MOLP5组和MOLP15组肉鸡的胰腺、心脏、肝脏、脾脏的重量差异不显著，与上述研究结果一致。Teteh等[18]在罗斯肉鸡日粮中添加1%和2%辣木叶，结果表明，1%和2%辣木叶均可提高肉鸡的肝脏、胰脏、脾、法氏囊和胸腺重量。Tesfaye等[19]研究发现，添加5%~20%的辣木叶均能够显著降低肉鸡腺胃和肠道重量。本试验中，MOLP20组茶花鸡9周龄的各器官的重量明显降低，对照组茶花鸡的腺胃重量高于其余各组，与上述研究结果一致。本试验中，各试验组茶花鸡的胸腺指数、胰脏指数、心脏指数、脾脏指数与对照组相比均具有增加的趋势，原因可能是辣木叶中含有的糖苷类物质可以提高肉鸡免疫器官质量和指数。3.3辣木叶粉对茶花鸡肠道微生物的影响为使家禽能够有效地消化饲料，胃肠道必须具有合适的酶活性和适宜的微生物群[20]。环境因素、饮食结构、基因的改变均可导致微生物的种类和比例产生很大差异[21]。研究发现，家禽肠道中常见的微生物有乳杆菌属、拟杆菌属、真杆菌属、梭菌属、大肠杆菌属、链球菌属、梭杆菌属、双歧杆菌属等[22]。本试验中，各试验组茶花鸡肠道的理研菌科RC9肠道群、链球菌属、瘤胃球菌属、拟杆菌属、另枝菌属、乳酸杆菌属、粪栖杆菌属、脱硫弧菌属等所占比例较高。徐帅等[23]基于高通量测定肉鸡回肠微生物多样性表明，在属分类水平上同组不同样本间存在差异，各组样本中拟杆菌属、理研菌属数量较多。本试验中，理研菌科RC9肠道群和拟杆菌属所占比例最高。Djakalia等[24]报道，辣木叶可能具有一定的抗菌活性，可用于控制致病菌；据观察，在鹌鹑饲料中加入辣木提取物能够强烈抑制革兰氏阴性、革兰氏阳性细菌和真菌[25]，这种抗菌活性可能主要与辣木叶片中存在的酚类化合物和类黄酮有关[26]。辣木叶中的黄酮类、皂苷类、多糖类、辣木素等成分能够调控小肠细胞生长因子并发挥抑菌作用，调节肠道菌群[27]，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌等表现出不同的抑制模式。本试验中，在日粮中加入辣木叶粉提高了茶花鸡有益菌如另枝菌属、Sphaerochaeta属、Mucispirillum属、Akkermansia属的比例，降低了有害菌如弯曲菌属、脱硫弧菌属等的比例，与上述研究一致。4结论本研究结果表明，在肉鸡日粮中加入辣木叶粉可以促进茶花鸡的肠道发育和器官发育，提高肠道指数和器官指数，促进有益菌在肠道内的定植，减少有害菌的数量，较适添加量为5%。