纤维素是构成植物细胞壁的重要成分[1]，常见的畜禽饲料如谷物、豆类、麦类及加工副产品等均含有大量的纤维素，但猪、鸡等单胃动物无法直接利用纤维素，反刍动物借助瘤胃微生物可以利用一部分纤维素，但是转化效率较低[2-3]。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）等起协同作用的多组分酶系组成，常用于动物饲料预处理，在纤维素转化和利用、饲料利用率和畜禽生产性能等方面具有重要意义[4-5]。β-葡萄糖苷酶又称β-D-葡萄糖苷水解酶，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，去除纤维素水解反应时纤维二糖的积累，从而提高纤维素的降解效率，是纤维素降解酶系的重要组分之一[6-7]。目前，生产中应用的产纤维素酶菌株以木霉属较多，其产生的内切及外切葡聚糖酶活力较高，但β-葡萄糖苷酶活力较低[8]。从自然界中筛选β-葡萄糖苷酶高产菌株，是提高纤维素酶系降解效率的重要方法。本试验从广西河池喀斯特地貌自然植被区筛选获得产β-葡萄糖苷酶菌株，鉴定其分类地位，并通过固体发酵技术初步优化菌株的产酶条件，以期为纤维素酶系的研究提供参考。1材料与方法1.1土样采集土样采自广西河池喀斯特地貌自然植被区，选取自然环境保持较好的地段，取地表下3~8 cm的土样100 g，无菌袋密封，运回实验室进行微生物分离。1.2培养基PDA培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂 15.0 g、加水定容至1 000 mL，自然pH值，121 ℃灭菌20 min[9-10]。察氏培养基：蔗糖30 g、NaNO3 3 g、K2HPO4 1 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 0.01 g、琼脂1%、蒸馏水1 000 mL，自然pH值，121 ℃灭菌20 min[11]。七叶苷显色筛选平板：七叶苷0.1%、柠檬酸高铁铵0.25%、琼脂1%，自然pH值，121 ℃灭菌20 min[12]。固体发酵复筛培养基：称取固体发酵粉10 g（麸皮4 g、蔗渣3 g、板栗壳渣3 g）至配制好的无机盐培养液中，每瓶30 mL。无机盐培养液中组成为：(NH4)2SO4 0.04%、KH2PO4 3%、MgSO4·7H2O 0.5%、CaCl2 0.05%，自然pH值，121 ℃灭菌20 min。1.3测定指标及方法1.3.1β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选和固体发酵条件优化1.3.1.1平板初筛称取10 g土壤，粉碎，加入90 mL无菌水混匀，梯度稀释法制备土壤稀释液，取10-3~10-5土壤稀释液各100 μL，涂布于七叶苷显色筛选平板，每个梯度重复3次。28 ℃培养后选取深褐色或黑色的菌落进行纯化[13]。1.3.1.2固体发酵条件优化取纯化后菌种制备孢子悬浮液，调整孢子液活菌数约107 CFU/mL，取1 mL孢子液接种到发酵培养基中，32 ℃培养4 d。加入300 mL无菌水振摇30 min，过滤，6 000 r/min离心10 min，取上清液测β-葡萄糖苷酶活性。以固体发酵培养基为出发培养基优化pH值，于筛选出的最佳pH值7.0条件下进行温度优化，并在筛选出的最适pH值7.0和最适温度28 ℃条件下进行装液量优化[14-15]。1.3.2β-葡萄糖苷酶活力参考文献[7]绘制葡萄糖标准曲线，采用DNS法测定β-葡萄糖苷酶活力，以每分钟生成1 mg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。1.3.3β-葡萄糖苷酶产生菌的鉴定将菌株接种至PDA培养基上，置于恒温培养箱内培养，观察其菌落形态特征，待产孢后，制作玻片，观察其显微镜下的形态特征，参照文献[16]至文献[17]进行形态学鉴定。1.3.4碳源和氮源利用试验以不含糖的察氏培养基为基础培养基，分别以果糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、甘露糖、乳糖、山梨糖和阿拉伯糖作为供试碳源，添加量为2%。以不含NaNO3的察氏培养基为基础培养基，分别以(NH4)2SO4、NaNO3、NH4Cl、尿素、酵母粉、蛋白胨和NaNO2作为供试氮源，添加量为0.3%。培养7 d，观察该菌的生长情况。1.3.5ITS序列同源性分析DNA提取采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技股份有限公司），采用引物ITS1和ITS4（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对提取的DNA进行扩增。PCR产物纯化后由华大基因测序，测序结果在NCBI通过BLAST进行比对分析。采用MEGA7.0软件进行序列同源性分析[18]，邻接归并法构建系统进化树[19]。2结果与分析2.1β-葡萄糖苷酶产生菌的平板初筛和固体发酵复筛结果采用七叶苷筛选平板从广西河池龙江河边喀斯特地貌自然植被区土壤中分离β-葡萄糖苷酶产生菌，筛选得到3株β-葡萄糖苷酶产生菌。使用DNS法分别测定B1、B2和B3菌株的β-葡萄糖苷酶活性分别为1.56、2.94、3.60 U/mL。选取产酶能力最高的B3菌株进行鉴定和培养条件优化。2.2β-葡萄糖苷酶产生菌的鉴定结果2.2.1β-葡萄糖苷酶产生菌的形态学鉴定结果（见图1）由图1（a）和（b）可知，菌株在PDA培养基上生长迅速，菌落边缘白色，中心淡褐色至黑色，质地紧密，菌丝呈分枝放射状，表面干燥，不透明。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.018.F001图1β-葡萄糖苷酶产生菌B3菌株的形态学特征由图1（c）和（d）可知，菌丝有隔、呈白色分支细杆状，分枝顶端膨大成球形顶囊，产生球形或椭圆形孢子，符合曲霉属（Aspergillus）特征，结合其菌落形态，初步确定该菌株为曲霉属真菌。2.2.2β-葡萄糖苷酶产生菌的生理生化指标检测结果（见表1）由表1可知，β-葡萄糖苷酶产生菌B3菌株能够很好地利用鼠李糖或麦芽糖作为唯一碳源进行生长，葡萄糖、山梨糖次之，几乎不能利用乳糖、阿拉伯糖，完全不能利用蔗糖，在果糖或甘露糖为唯一碳源的培养基上也能够生长，但是生长一般。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.018.T001表1β-葡萄糖苷酶产生菌的生理生化指标检测结果碳源结果氮源结果鼠李糖+++酵母粉+++麦芽糖+++蛋白胨+++葡萄糖++氯化铵++山梨糖++硝酸钠++果糖+硫酸铵++甘露糖+尿素±乳糖±亚硝酸钠-阿拉伯糖±蔗糖-注：“+++”为菌株生长良好，“++”为菌株生长较好，“+”为菌株生长一般，“±”为菌株略有生长，“-”为菌株不能生长[20]。氮源利用结果显示，β-葡萄糖苷酶产生菌B3菌株能够很好地利用酵母粉或蛋白胨作为唯一氮源进行生长，氯化铵、硝酸钠、硫酸铵次之，在以尿素为唯一氮源的培养基上略有生长，不能利用亚硝酸钠。2.2.3β-葡萄糖苷酶产生菌的ITS序列同源性分析结果（见图2、图3）由图2可知，扩增该菌株的rDNA-ITS序列，得到大小约500 bp的片段。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.018.F002图2B3菌株的DNA提取和ITS序列扩增结果注：M为marker DL2000，1为B3菌株提取总DNA，2为B3菌株ITS序列扩增片段。测序后BLAST发现，此序列与棘孢曲霉菌（Aspergillus aculeatus）LC514695、JQ670921等的匹配率均达到99%以上。选取同源性较高的菌株作为参比对象构建进化树，由图3可知，系统发育分析结果表明，该菌与棘孢曲霉的菌株聚在一起。根据形态特征及ITS序列同源性分析结果，确定其为棘孢曲霉（A. aculeatus）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.018.F003图3β-葡萄糖苷酶产生菌B3菌株的系统发育分析注：进化距离使用最大似然数法计算［21］，以每个位点的碱基替换数为单位。进行1 000 次的相似度重复计算，括号内为各序列的Gen Bank检索号。2.3β-葡萄糖苷酶产生菌的发酵条件优化结果2.3.1pH值对菌株B3产β-葡萄糖苷酶的影响（见图4）由图4可知，处于偏酸性环境时β-葡萄糖苷酶的酶活较低，随pH值升高酶活也表现出升高趋势，pH值为7.0时达到最高值（19.40 U/mL）；pH值大于7.0的酶活逐渐降低。研究表明，该棘孢曲霉菌株产β-葡萄糖苷酶的最适pH值为7.0。若以酶活保持在80%以上作为β-葡萄糖苷酶pH值稳定范围，则该棘孢曲霉菌株产酶能力在pH值为5.0~7.5内稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.018.F004图4不同pH值对菌株B3产β-葡萄糖苷酶的影响2.3.2温度对菌株B3产β-葡萄糖苷酶的影响（见图5）由图5可知，当温度在24~28 ℃时，随着温度上升，菌株B3产β-葡萄糖苷酶酶活逐渐升高，28 ℃时达最高值（30.36 U/mL），随着温度继续升高，菌株B3产β-葡萄糖苷酶酶活逐渐降低。因此，选择28 ℃为该棘孢曲霉菌株产β-葡萄糖苷酶的最适温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.018.F005图5不同温度对菌株B3产β-葡萄糖苷酶的影响2.3.3装液量对菌株B3产β-葡萄糖苷酶的影响（见图6）由图6可知，当培养液的量在10~30 mL/250 mL时，菌株B3产β-葡萄糖苷酶的酶活上升缓慢，随后快速升高，在装液量为40 mL/250 mL时达到最大值42.75 U/mL。因此，选择40 mL/250 mL为菌株B3产β-葡萄糖苷酶的最适装液量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.018.F006图6不同装液量对菌株B3产β-葡萄糖苷酶的影响3讨论利用纤维素酶预处理动物饲料，可有效补充畜禽动物体内纤维素酶的不足，帮助转化不溶性纤维素成葡萄糖，在提高动物饲料转化率中发挥重要作用[22]。但酶制剂在动物生产中应用需要适应不同的动物胃肠道环境。因此，选择环境适应性强、产量稳定、产酶量高的菌株在纤维素酶研发过程中具有重要意义。目前，关于微生物β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、细菌、真菌等，真菌来源的β-葡萄糖苷酶最适pH值多为3.5~5.5，限制了β-葡萄糖苷酶在饲料生产中的应用。本研究筛选得到1株β-葡萄糖苷酶产生菌，鉴定为棘孢曲霉（A. aculeatus）。棘孢曲霉是一种丝状真菌，真菌可以通过菌丝体或孢子进行发酵。本试验中，菌株在pH值5.0~7.5范围内达到了较高的产酶水平，中性条件下产酶量最高。本研究采用七叶苷显色技术筛选β-葡萄糖苷酶产生菌，以固体发酵技术进行产酶条件优化。此方法简单快捷，筛选效率高，适用于产β-葡萄糖苷酶菌株的初期筛选。本研究将水不溶性的蔗渣、板栗壳渣等作为培养基质悬浮在无机盐溶液中培养初筛获得的产酶菌株，经优化后达到了较高产酶能力。结果表明，可使用板栗壳、蔗渣、麸皮作为唯一碳源生产用于饲料添加剂的高产酶活性菌株，对β-葡萄糖苷酶的产业化应用具有重要价值。4结论本试验采用七叶苷显色技术筛选得到1株β-葡萄糖苷酶产生菌，将其鉴定为棘孢曲霉（A. aculeatus），并通过固体发酵对反应条件进行了优化。结果发现，该棘孢曲霉产β-葡萄糖苷酶的最适pH值为7.0。最适温度为28 ℃，最适装液量为40 mL/250 mL。经过优化后，该株棘孢曲霉的产酶能力达到了42.75 U/mL，相较于出发条件提高了10.9倍。