甘蔗是我国重要的糖料作物[1]，约占食糖总量的90%[2]。蔗糖产业是云南省高原特色产业，2019年和2020年榨季，云南甘蔗种植面积约为28.993万hm2[3]。甘蔗在生产过程中，会产生大量的蔗梢和蔗叶等甘蔗副产物，蔗梢是收获甘蔗时顶上最嫩节及青绿叶片[4]，其含粗纤维（33%左右）、粗蛋白质（3%~6%）、粗脂肪（1%左右）、氨基酸以及维生素等营养成分[5]。目前，蔗梢青贮仍以自然青贮为主，其品质不稳定、易发生腐败变质等。研究表明，乳酸菌是一类发酵的益生菌[6]，其中乳杆菌属、乳球菌属等[7]是制作青贮饲料常见的菌群。添加微生物菌剂可提升青贮品质、有效解决青贮蔗梢腐败变质等问题[8-9]，延长青贮饲料贮存周期，缓解反刍动物越冬饲草不足的矛盾。研究表明，植物乳杆菌与布氏乳杆菌联合（2×106 CFU/g鲜重）发酵甘蔗尾，能够有效提高青贮品质和有氧稳定性[10]；添加布氏乳杆菌青贮玉米秸秆，可显著增强青贮饲料的有氧稳定性，破坏纤维结构，进而提高饲料的消化率[11]；添加副干酪乳杆菌青贮苜蓿，可有效提高青贮饲料的有氧稳定性，减缓有氧变质[12]。目前，关于甘蔗内源性乳杆菌的筛选与应用未见相关研究报道，对蔗梢专用的乳酸菌制剂的研究与开发较少[13]。本试验通过研究1株分离自蔗梢的内源性副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌对青贮蔗梢有氧稳定性及品质的影响，为蔗梢青贮专用发酵菌剂的研发提供参考。1材料与方法1.1试验材料ROC 22蔗梢由云南省农业科学院甘蔗研究所第一实验基地提供。内源副干酪乳杆菌从蔗梢中分离，前期已完成16S rDNA通用引物基因测序和同源性分析。植物乳杆菌及布氏乳杆菌购自上海保藏生物技术中心（D24318、D24284）。1.2试验设计1.2.1菌种活化将菌种接种于MRS琼脂培养基中培养24 h，使用接种环挑取单菌落于MRS液体培养基扩培48 h，离心，使用无菌生理盐水洗涤2次，使用生理盐水重悬并适当稀释，于紫外分光光度计570 nm波长下调至吸光值为2.00。接种菌体参照黄立坤等[14]MTT法测定乳酸菌活菌数，测得吸光度与平板计数关系y=1.100 6x-0.885 5，R2=0.998 0，获得初始菌体含量为1.35×109 CFU/mL。1.2.2蔗梢青贮处理菌剂的稀释和定容剂均为8.5‰无菌生理盐水，菌剂发酵组分别设置副干酪乳杆菌、植物乳杆菌及布氏乳杆菌添加水平为0.05%、0.10%、0.20%，按添加量喷施稀释为5 mL活化后的菌剂，阴性对照组（CK组）喷施5 mL无菌生理盐水。蔗梢青贮菌剂添加量见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.022.T001表1蔗梢青贮菌剂添加量组别菌种含量/%布氏乳酸菌/(CFU/g)植物乳酸菌/(CFU/g)副干酪乳酸菌/(CFU/g)CK组—————BS1组布氏乳杆菌0.050.375×109——BS2组0.100.675×109——BS3组0.201.350×109——ZW1组植物乳杆菌0.05—0.375×109—ZW2组0.10—0.675×109—ZW3组0.20—1.350×109—GL1组副干酪乳杆菌0.05——0.375×109GL2组0.10——0.675×109GL3组0.20——1.350×109注：“—”为未添加。接种菌剂充分混匀，转移至避光的塑料袋中，密封，置于120 L塑料储物箱（66 cm×44 cm×40 cm）内，以重物压实，盖上盖子，常温裹膜青贮30 d。鲜梢或发酵后的蔗梢转移至托盘中，置于烘箱内65 ℃下烘干72 h，粉碎，过40目筛网。1.3测定指标及方法1.3.1感官评定参照《青贮饲料品质鉴定》（DB50/T 669—2016）从色泽、质地、气味以及霉变情况对蔗梢青贮进行评定。1.3.2青贮稳定性蔗梢青贮的水分含量使用便携式水分测定仪测定，参照王郝为等[15]方法测定pH值。参照唐振华等[10]方法测定有氧稳定性，样品置于阴暗处，每8 h使用温度计置于样品内部，测定温度变化并记录，直至青贮物料的温度超过环境温度2 ℃时为止。按照DB15/T 1458—2018方法测定氨态氮含量。1.3.3营养成分参照余汝华等[16]的方法测定可溶性碳水化合物，按照《饲料中粗蛋白的测定》（DB13/T 1098—2009）凯式定氮法测定粗蛋白质含量，按照《饲料中粗脂肪的测定》（GB/T 6433—2006）索式浸提法测定粗脂肪含量。1.3.4纤维含量测定粗纤维按照范式洗涤纤维法测定[17]，中性洗涤纤维按照《饲料中中性洗涤纤维（NDF）的测定》（GB/T 20806—2006），酸性洗涤纤维按照《饲料中酸性洗涤纤维的测定》（NY/T 1459—2007），酸性洗涤木质素按照《饲料中酸性洗涤木质素（ADL）的测定》（GB/T 20805—2006），纤维素、半纤维素、木质素参照王金主等[18]方法进行测定。1.3.5有机酸含量蔗梢中有机酸测定参考白杰[19]等的方法。蔗梢样品经振荡提取24 h，经十八烷基（封端）固相萃取柱（C18，3 mL，Amicrom）过滤，再用0.45 μm水系滤膜过滤，过滤后的浸提液进液相色谱分析。色谱条件：高效液相色谱（Waters E2695沃谱达（苏州）有限公司），紫外检测器（Waters 2489）；色谱柱SunFireTM-C18柱（4.6 mm×250 mm×5 µm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.02 mol/L NaH2PO4（磷酸调节pH值至2.70）。等梯度洗脱，流动相为14%A、86%B，单个样品运行时间25 min，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长210 nm，进样体积10 μL。1.3.6微生物菌群计数取发酵后的蔗梢鲜样按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）处理，生理盐水梯度稀释后涂布于不同培养基上37 ℃培养，观察。菌落总数采用平板计数琼脂培养基（PCA），乳酸菌采用乳酸菌琼脂培养基（MRS），酵母/霉菌采用麦芽浸粉琼脂培养基（MEA）进行测定。1.4数据统计与分析数据采用Excel软件进行处理，Origin 2021制图及SPSS 22.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同乳杆菌对蔗梢青贮感官评定的影响（见表2）由表2可知，试验各组蔗梢青贮的色泽、质地及所得评分均达到优级水平（72~100分），其中GL3组蔗梢青贮评分最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.022.T002表2不同乳杆菌对蔗梢青贮感官评定的影响组别气味色泽质地长霉情况评分评级CK组酸香淡黄带黏性＋＋＋＋＋73.82±0.98a优BS1组酸香淡黄带黏性＋＋＋75.04±1.23a优BS2组酸香淡黄松软＋＋＋76.23±0.80ab优BS3组酸香黄绿松软＋＋79.11±0.79bc优ZW1组酸香淡黄带黏性＋＋＋75.29±1.06a优ZW2组酸香淡黄松软＋＋＋77.56±1.54ab优ZW3组酸香淡黄松软＋＋＋78.15±1.20b优GL1组酸香淡黄松软＋＋＋76.35±1.89ab优GL2组酸香黄绿松软＋＋80.78±1.46bc优GL3组酸香黄绿松软＋＋82.12±0.78c优注：1.同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.“+”表示长霉情况，“+”越多长霉越严重。2.2不同乳杆菌对蔗梢青贮稳定性的影响（见表3）由表3可知，各组蔗梢青贮的水分含量差异均不显著（P0.05），表明青贮时密封良好。鲜蔗梢的初始pH值为5.83，经青贮后各组的pH值均降低，BS3组蔗梢青贮的pH值最低，为4.28，pH值降低后可以有效抑制蔗梢腐败变质，有助于青贮饲料的长期储存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.022.T003表3不同乳杆菌对蔗梢青贮稳定性的影响（干物质基础）组别水分/%pH值氨态氮/(g/kg)有氧稳定时间/hCK组30.14±1.364.79±0.45c7.99±0.09a104.00±1.15aBS1组31.12±1.934.62±0.48ab9.00±0.08ab128.00±1.48abBS2组31.00±2.144.35±0.36a9.01±0.21ab184.00±0.96cBS3组30.38±2.274.28±0.42a9.15±0.12b200.00±0.82cdZW1组31.10±1.404.70±0.29c9.17±0.08b112.00±1.01aZW2组31.97±2.924.65±0.23bc9.62±0.09b120.00±0.23abZW3组31.77±1.554.30±0.40a10.03±0.10bc192.00±0.80 cGL1组31.32±1.054.61±0.35c10.06±0.14bc128.00±0.95abGL2组31.48±2.084.43±0.38c10.65±0.31c168.00±0.79bGL3组30.71±1.944.51±0.38bc10.69±0.09c216.00±1.24d添加菌剂发酵的各试验组蔗梢青贮的氨态氮含量均高于对照组，其中GL3组蔗梢青贮的氨态氮含量最高，为10.69 g/kg。添加菌剂发酵的各试验组蔗梢青贮的有氧稳定时间均高于对照组，GL3组蔗梢青贮的有氧稳定时间最长，为216 h，显著高于对照组（P0.05）。2.3不同乳杆菌对蔗梢青贮营养成分的影响（见表4）由表4可知，添加菌剂发酵的各试验组蔗梢青贮的可溶性碳水化合物含量显著降低（P0.05）。GL2组蔗梢青贮的粗蛋白质含量、GL3组的粗脂肪含量在所有实验组组中含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.022.T004表4不同乳杆菌对蔗梢青贮营养成分的影响组别可溶性碳水化合物粗蛋白质粗脂肪CK组6.21±0.13d6.32±0.018b0.92±0.07aBS1组4.60±0.04ab6.15±0.03a0.92±0.01aBS2组4.44±0.06a6.19±0.00a0.97±0.13aBS3组4.35±0.05a6.34±0.00bc0.99±0.04aZW1组5.72±0.07cd6.31±0.04b1.02±0.10abZW2组4.83±0.07b6.44±0.05bc1.03±0.03abcZW3组4.76±0.07b6.33±0.02b1.21±0.03bcdGL1组6.04±0.10d6.38±0.03bc1.20±0.03aGL2组5.52±0.13cd6.54±0.00c1.22±0.03cdGL3组5.05±0.06bc6.46±0.03bc1.31±0.00d%2.4不同乳杆菌对蔗梢青贮的纤维含量的影响（见表5）由表5可知，蔗梢青贮的粗纤维的含量在植物乳杆菌ZW3组中最高，副干老乳杆菌三组整体偏高，CK组中最低，GL3组蔗梢青贮半纤维素青贮含量最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.022.T005表5不同乳杆菌对蔗梢青贮的纤维含量的影响组别粗纤维中性洗涤纤维酸性洗涤纤维酸性洗涤木质素半纤维素木质素CK组33.29±0.26ab68.24±0.08ab39.59±0.23a6.31±0.03a30.64±0.16e4.56±0.50aBS1组33.03±0.24ab69.07±0.59ab39.83±0.41a6.79±0.17a29.24±0.18de5.00±0.34abBS2组33.33±0.02ab69.62±0.65b39.78±0.45a6.44±0.46a29.84±0.21de4.58±0.45abBS3组33.35±0.15a69.49±0.80b38.82±0.06a6.47±0.20a29.67±0.74e4.56±0.18aZW1组33.19±0.32a67.48±0.12a38.89±0.30a6.69±0.02a28.59±0.19bcd4.62±0.22aZW2组33.45±0.03a68.37±0.34ab39.16±0.14a6.70±0.16a29.22±0.47de4.82±0.07aZW3组34.90±0.10c67.43±0.26ab41.08±0.23b6.58±0.27a26.61±0.08a5.00±0.19abGL1组34.36±0.97bc68.66±0.61ab41.83±0.32bc7.74±0.64ab26.83±0.93ab5.47±0.05abGL2组34.07±0.71bc68.24±0.47ab41.06±0.31b6.99±1.02ab27.17±0.15abc5.03±0.11abGL3组34.10±0.04bc68.01±0.48ab41.95±0.50c8.35±0.55b25.56±0.98a5.91±0.47b%2.5不同乳杆菌对蔗梢青贮有机酸含量的影响（见表6）根据臧艳运等[20]提出新的青贮饲料发酵品质评定标准，乙酸含量≤3.0 g/kg、丁酸含量为0~0.3 g/kg属于一级。由表6可知，对照组蔗梢青贮的乳酸和乙酸的含量最低，所有试验组乙酸与丁酸含量均在品质评定指标的一级。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.022.T006表6不同乳杆菌对蔗梢青贮有机酸含量的影响组别乳酸乙酸丙酸丁酸CK组1.07±0.29a1.20±0.57a0.25±0.29a0.12±0.04aBS1组1.25±0.32ab1.80±0.80ab0.46±0.51a0.11±0.06aBS2组1.28±0.35ab2.42±0.54ab0.42±0.56a0.14±0.07aBS3组1.48±0.65b2.61±0.52b0.18±0.30a0.12±0.09aZW1组1.80±0.77c1.75±0.78ab0.67±0.71a0.10±0.05aZW2组1.82±0.71c2.03±1.07ab0.51±0.51a0.11±0.06aZW3组1.83±0.44c2.03±0.98ab0.48±0.61a0.06±0.03aGL1组1.42±0.55b1.48±0.71ab0.19±0.25a0.09±0.09aGL2组1.68±0.05bc1.63±0.79ab0.23±0.30a0.13±0.07aGL3组1.79±0.72c1.73±0.77ab0.16±0.21a0.06±0.07ag/kg2.6不同乳杆菌对蔗梢青贮微生物菌群的影响（见表7）由表7可知，对照组蔗梢青贮的菌落总数最多，酵母/霉菌含量最高，长霉情况等级最严重。BS3组蔗梢青贮的乳酸菌活菌数最高，GL3组霉菌和长霉情况等级最低，各植物乳杆菌组长霉情况无肉眼差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.022.T007表7不同乳杆菌对蔗梢青贮微生物菌群的影响组别菌落总数乳酸菌酵母/霉菌CK组2.82×108d0.93×108a8.88×105cBS1组1.97×108b1.10×108a6.55×105bBS2组2.09×108bc1.28×108b6.41×105bBS3组2.42×108c1.32×108b6.14×105bZW1组1.16×108a1.11×108a6.04×105bZW2组1.27×108a1.17×108a5.66×105abZW3组1.82×108b1.53×108c5.44×105abGL1组1.75×108ab1.00×108a6.16×105bGL2组1.98×108b1.07×108a5.16×105abGL3组2.73×108d1.16×108ab3.70×105aCFU/mL3讨论3.1不同乳杆菌对蔗梢青贮感官评定的影响青贮饲料具有浓郁发酵味，颜色比较接近蔗叶色，质地松软可以评为优级。本试验中，各试验组蔗梢青贮饲料均评为优级，可能是由于发酵时间短，区别不显著，但对照组和0.05%植物乳杆菌组已开始呈现黏性，大部分试验组叶片开始出现淡黄色，而添加副干酪乳杆菌能够保持黄绿色，表明副干酪乳杆菌对蔗梢的保鲜效果优于布氏乳杆菌和植物乳杆菌。可能与副干酪乳杆菌能够产生大量的胞外多糖及多糖有较高的持水性有关[21]。3.2不同乳杆菌对蔗梢青贮稳定性的影响乳杆菌的发酵过程中产生大量的乳酸，能够快速降低pH值，抑制酵母、霉菌等有害菌生长[10]。本试验中，各乳杆菌蔗梢青贮的pH值均低于对照组，pH值与添加的乳杆菌的剂量、有氧稳定时间成正比。可能是乳杆菌代谢产生有机酸，降低pH值，弱酸性环境能够抑制有害菌生长，从而提升青贮蔗梢有氧稳定性。舒梨[22]研究表明，副干酪乳杆菌产生的副干酪菌素在pH值≥7.0条件下活性降低，甚至失活。3.3不同乳杆菌对蔗梢青贮营养成分的影响本试验中，添加菌剂蔗梢青贮的可溶性碳水化合物低于对照组，表明乳酸菌生长需要适量的碳源，且不同乳酸菌利用碳源能力不同。粗蛋白是饲料评价的关键指标，甘蔗梢的粗蛋白约4.13%[23]。本试验中，各试验组蔗梢青贮的粗蛋白质含量为6.15%~6.54%，略高于梁辛等[24]报道的5.98%。粗蛋白含量的提升可能与微生物菌体细胞蛋白有关，添加菌剂的青贮蔗梢粗蛋白质主要源于乳杆菌，而自然青贮组中的粗蛋白提升可能大部分源于高含量的酵母或霉菌，因此本试验中大部分试验组蔗梢青贮的粗蛋白含量高于对照组。本试验中，各菌剂添加组蔗梢青贮的粗脂肪含量均高于或等于对照组，且GL3组蔗梢青贮的粗脂肪含量最高，为1.31%。郑晓灵等[25]研究表明，添加菌剂青贮蔗梢可以显著提高粗脂肪含量。本试验中，蔗梢青贮的中性洗涤纤维含量为67.48%~69.92%，酸性洗涤纤维含量为38.82%~41.95%，与余梅等[23]研究结果基本一致。3.4不同乳杆菌对蔗梢青贮有机酸及微生物菌群的影响有机酸是青贮饲料的重要评价指标。本试验中，所有发酵组有机酸含量均在同一级别，可能是发酵时间不长不足以区分。微生物菌群结构与青贮品质紧密相关，研究表明，副干酪乳杆菌具有广泛的抑菌谱，可抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等多种腐败菌和致病菌[22]。乳酸菌的含量降低，可能导致蔗梢饲料长霉严重，品质降低，严重时可导致饲料腐败。本试验筛选得到的内源副干酪乳杆菌性能的检测取得了较为理想的结果，但对青贮蔗梢的有氧稳定性和品质还有很大的提升空间，未来还需要进一步研发。4结论添加分离自蔗梢的内源副干酪乳杆菌能够降低蔗梢青贮的pH值，提升有氧稳定性，增加蔗梢青贮粗蛋白和粗脂肪的含量，有效降低半纤维素和木质素含量，提高青贮品质，丰富乳酸菌群含量，产生适量有机酸，从而有效抑制霉变。综合分析认为蔗梢的内源副干酪乳杆菌可以有效地提高蔗梢青贮的有氧稳定性和青贮品质，且适宜添加量为0.20%。