近年来，随着水产养殖业快速发展，集约化养殖范围逐步扩大，出现了养殖成本高、环境恶化等问题[1]。生物发酵饵料是解决这些问题的有效方法之一。在微生物发酵过程中，饲料原料内的营养物质发生了一系列生化反应，将一些有机物分解为容易吸收的小分子肽[2]，产生香味，从而提高适口性、饲料利用率和抗病力，降低养殖成本[3-5]。因此，生物发酵技术在水产动物配合饵料的生产及应用中具有重要作用。常见的发酵益生菌有酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。酿酒酵母菌属于单细胞真核微生物，含有蛋白质、糖类、维生素等营养物质，可以提高饲料品质、调节肠道微生物，将大分子营养物质降解为小分子[6]。枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，自身可产生芽孢，其代谢产物含有抗菌物质，可提高机体免疫力和抗病力[7]。植物乳杆菌也是一种革兰氏阳性菌，但无芽孢，可改善机体肠道功能、促进消化、抑制病原体生长[8]。研究表明，不同菌种的发酵效果不同，且复合发酵效果优于单一菌种[9]。蛋白质作为鱼类第一大营养物质，在半滑舌鳎配合饵料中主要以高成本鱼粉的形式供给，存在养殖成本高、饲料利用率低的缺点[10]。因此，本研究通过酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵半滑舌鳎配合饵料，以酸溶蛋白为主要评价指标筛选最适菌种、接种比例及发酵天数，并通过养殖试验验证发酵条件的优化效果，为提高半滑舌鳎全价配合饵料发酵工艺提供参考。1材料与方法1.1试验材料半滑舌鳎全价配合饵料购自山东升索饲料科技有限公司，其常规成分含量见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T001表1半滑舌鳎全价配合饲料营养成分营养成分粗蛋白粗脂肪粗灰分酸溶蛋白含量54.2011.9613.0811.18%植物乳杆菌（1×1010 CFU/g）购自青岛根源生物集团，枯草芽孢杆菌（2×1010 CFU/g）、酿酒酵母菌（2×1010 CFU/g）购自青岛蔚蓝生物股份有限公司。1.2发酵试验1.2.1发酵菌种的确定取半滑舌鳎全价配合饵料100 g，总菌种接种量为3%，设置8个试验组，各组饵料接种菌种及剂量见表2。设置料液比1∶0.3 g/mL，将菌种加水活化，35 ℃发酵5 d，确定最佳发酵菌种。各组饵料接种菌种及剂量见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T002表2各组饵料接种菌种及剂量组别接种菌种及剂量D0组（对照组）无菌种接种D1组3.0%酿酒酵母D2组3.0%植物乳杆菌D3组3.0%枯草芽孢杆菌D4组1.5%酿酒酵母+1.5%植物乳杆菌D5组1.5%酿酒酵母+1.5%枯草芽孢杆菌D6组1.5%植物乳杆菌+1.5%枯草芽孢杆菌D7组1.0%酿酒酵母+1.0%枯草芽孢杆菌+1.0%植物乳杆菌1.2.2发酵比例及天数的优化根据1.2.1得出的最优菌种发酵组合，共设6个试验组，取半滑舌鳎全价配合饵料100 g分别接种不同比例的酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌，各组接种菌种及剂量见表3。设置料液比1∶0.3 g/mL，菌种加水活化，35 ℃发酵6 d，每天取样1次，确定最优发酵菌种比例及发酵天数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T003表3各组饵料的接种菌种及剂量组别接种菌种及剂量L1组0.5%酿酒酵母+1.0%枯草芽孢杆菌+1.5%植物乳杆菌L2组0.5%酿酒酵母+1.5%枯草芽孢杆菌+1.0%植物乳杆菌L3组1.0%酿酒酵母+0.5%枯草芽孢杆菌+1.5%植物乳杆菌L4组1.0%酿酒酵母+1.5%枯草芽孢杆菌+0.5%植物乳杆菌L5组1.5%酿酒酵母+0.5%枯草芽孢杆菌+1.0%植物乳杆菌L6组1.5%酿酒酵母+1.0%枯草芽孢杆菌+0.5%植物乳杆菌1.2.3发酵饵料营养水平测定酸溶蛋白（ASP）含量采用QB/T 2653—2004标准测定，粗蛋白（CP）含量使用凯氏定氮法测定,粗脂肪（CL）含量使用索氏抽提法（石油醚为溶剂）测定，粗灰分（Ash）含量使用高温灼烧法测定。将饵料粉碎加50 mL水溶解，使用pH计检测pH值。酿酒酵母菌采用GB/T 22547—2008进行检测，枯草芽孢杆菌采用GB/T 26428—2010进行检测，植物乳杆菌采用DB37/T 3405—2018进行检测。1.3半滑舌鳎养殖试验1.3.1试验设计养殖试验于山东省海洋资源与环境研究院东营实验基地循环水养殖系统试验室。选取健康、平均体重为（80.27±0.19）g的半滑舌鳎300尾，随机分为2组，每组3个重复，每个重复50尾鱼。对照组半滑舌鳎饲喂配合饵料，试验组在配合饵料中添加10%发酵饵料（按照优化试验所得最适条件发酵饵料）。试验期56 d。1.3.2生长性能的测定试验第1 d和最后1 d，统计试验组半滑舌鳎的体重及采食量，计算特定生长率、饵料系数、蛋白质效率、存活率等指标。体增重=末重-初重(1)特定生长率=(ln末重-ln初重)/试验天数×100%(2)饵料系数=摄食量/体增重(3)蛋白质效率=体增重/(摄食量×饵料蛋白质含量)×100%(4)存活率=试验末数量/试验初始数量×100%(5)1.4数据统计与分析采用SPSS 17.0软件进行单样本t检验检测数据分布的正态性，单因素方差分析进行多个样本比较，Duncan's法多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵菌种优化结果2.1.1不同菌种对发酵饵料ASP、CP含量及pH值的影响（见表4）由表4可知，D7组发酵饵料的ASP含量最高，显著高于对照组（P0.05）。各试验组发酵饵料的CP含量与对照组相比均有所降低，D2组~D7组发酵饵料CP含量显著低于对照组（P0.05）。D2组、D4组、D6组及D7组发酵饵料的pH值均显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T004表4不同菌种对发酵饵料ASP、CP含量及pH值的影响组别ASP/%CP/%pH值D0组（对照组）12.06±0.03a57.98±0.47c5.87±0.02dD1组11.54±0.36a54.55±0.22bc5.85±0.01cdD2组10.50±0.36a52.51±0.32a5.75±0.04bD3组12.41±0.37ab52.62±0.36a6.00±0.02eD4组11.30±0.91a53.31±0.32ab5.64±0.03aD5组12.65±0.96ab52.95±0.37a5.88±0.03dD6组12.14±0.47a52.10±0.70a5.82±0.05bcD7组14.50±0.36b52.95±0.02a5.77±0.01bc注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表11与此同。2.1.2不同菌种对发酵饵料活菌数的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，试验各组发酵菌种活菌数均提高十万倍左右。研究表明，D7组发酵饵料的发酵效果较好。因此，后续选择3种菌种复合发酵进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T005表5不同菌种对发酵饵料活菌数的影响组别酿酒酵母菌枯草芽孢杆菌植物乳杆菌D0组（对照组）1×1087.6×1031.3×102D1组9×108——D2组——8.0×107D3组—6.1×108—D4组14×108—7.8×107D5组11×1083.3×108—D6组—9.3×1089.3×107D7组5×1082.3×1086.3×107注：“—”表示未检测到数据。CFU/g2.2复合菌种比例及发酵时间对发酵饵料ASP含量、CP营养成分及pH值的影响（见表6~表10）由表6可知，发酵1~6 d，L2组、L4组发酵饵料的ASP含量均呈先上升后下降的趋势，在发酵第5 d达到最高值，显著高于其他发酵时间（P0.05）；L3组发酵饵料发酵第5 d的ASP含量高于其他组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T006表6复合菌种比例及发酵时间对发酵饵料ASP含量的影响组别发酵时间1 d2 d3 d4 d5 d6 dL1组10.98±0.50a13.12±0.68b13.16±0.17b12.96±0.35ab14.15±0.03b12.74±0.29abL2组11.05±0.39a13.12±0.22bc12.65±0.31b13.85±0.16c14.82±0.03d12.64±0.19bL3组12.22±0.03a12.72±0.28ab12.66±0.07ab13.15±0.10b13.87±0.11c12.67±0.31abL4组12.41±0.27ab12.23±0.67a12.74±0.24ab13.51±0.33b14.79±0.06c13.54±0.18bL5组11.63±0.1412.54±0.1812.31±0.0412.92±0.0611.86±1.3212.54±0.12L6组11.89±0.5211.93±0.4311.93±0.5812.40±0.2512.87±0.0612.69±0.01注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。由表7可知，发酵6 d，各组发酵饵料CP含量均出现下降现象。与发酵1 d相比，L2组发酵第5 d发酵饵料的CP含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T007表7复合菌种比例及发酵时间对发酵饵料CP含量的影响组别发酵时间1 d2 d3 d4 d5 d6 dL1组52.78±0.38b52.24±0.03ab52.59±0.29b52.10±0.15ab52.27±0.01ab51.44±0.49aL2组53.85±0.72b52.68±0.21a52.63±0.15a52.48±0.13a52.25±0.10a51.92±0.19aL3组52.25±0.13ab51.73±0.73ab52.18±0.15ab52.71±0.11b52.00±0.17ab51.49±0.14aL4组52.92±0.02bc53.33±0.28c52.55±0.04ab52.77±0.36bc52.33±0.24ab51.90±0.09aL5组52.99±0.1053.34±0.0053.29±0.1752.82±0.2552.88±0.2251.36±0.12L6组53.00±0.1553.01±0.1653.26±0.2553.60±0.1953.36±0.1051.65±0.17由表8、表9可知，各试验组发酵饵料发酵6 d的粗脂肪及粗灰分含量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T008表8复合菌种比例及发酵时间对发酵饵料粗脂肪含量的影响组别发酵时间1 d2 d3 d4 d5 d6 dL1组12.08±0.3712.34±0.1611.72±0.2712.19±0.0811.97±0.0812.14±0.12L2组12.21±0.1312.31±0.2312.26±0.0912.11±0.1311.89±0.1712.12±0.21L3组12.22±0.1412.12±0.1412.01±0.1912.20±0.1712.10±0.2312.28±0.12L4组12.20±0.1512.01±0.1511.93±0.1112.26±0.1912.30±0.0812.23±0.15L5组12.18±0.1212.27±0.1112.29±0.2312.33±0.1712.44±0.2311.99±0.16L6组12.26±0.1311.97±0.2311.82±0.1912.11±0.1511.93±0.1912.20±0.1610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T009表9复合菌种比例及发酵时间对发酵饵料粗灰分含量的影响组别发酵时间1 d2 d3 d4 d5 d6 dL1组12.75±0.2412.72±0.1513.00±0.2713.15±0.1712.97±0.1312.74±0.11L2组12.76±0.1213.10±0.2013.04±0.1812.64±0.2312.68±0.1913.02±0.28L3组12.89±0.1412.38±0.2812.54±0.1912.54±0.1712.37±0.2512.48±0.26L4组12.45±0.2012.43±0.2712.65±0.1912.52±0.1812.46±0.3012.30±0.24L5组12.48±0.1512.76±0.2712.66±0.2212.54±0.2412.53±0.2112.72±0.12L6组12.56±0.2612.75±0.1313.14±0.2712.57±0.2912.64±0.2613.10±0.29由表10可知，L2组发酵饵料的pH值显著低于L4组（P0.05）。研究表明，L2组发酵饵料的效果优于其他试验组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T010表10复合菌种比例对发酵饵料发酵5 d pH值的影响项目L1组L2组L3组L4组L5组L6组pH值5.63±0.02ab5.60±0.01a5.64±0.01ab5.67±0.03b5.63±0.01ab5.63±0.02ab2.3复合益生菌发酵饵料对半滑舌鳎生长性能的影响（见表11）由表11可知，与对照组相比，试验组半滑舌鳎体增重与特定生长率均显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.010.T011表11复合益生菌发酵饵料对半滑舌鳎生长性能的影响组别体增重/g特定生长率/(%/d)饵料系数蛋白质效率/%肥满度/(g/cm3)存活率/%对照组35.90±5.24a0.66±0.08a1.29±0.24152.12±23.644.54±0.1398.33±0.88发酵饲料组57.60±6.84b0.97±0.09b0.92±0.09202.31±19.244.76±0.0999.67±0.333讨论目前，关于发酵工艺的研究多围绕以豆粕等饲料蛋白源为底物[11]，对全价配合饲料发酵的研究还不够深入。全价配合饲料发酵技术的优点是方便、快捷，具有较大的应用潜力。本研究经过第一阶段发酵，发现接种单一菌种时枯草芽孢杆菌ASP的含量升高，推测该条件下枯草芽孢杆菌达到最优发酵效果。丁毅等[12]分别使用枯草芽孢杆菌和乳酸菌发酵豆粕，发现试验组发酵豆粕ASP含量显著高于对照组，枯草芽孢杆菌组发酵豆粕ASP含量是乳酸菌组的3倍。结合本研究可推测单一菌种发酵时的最佳接种益生菌为枯草芽孢杆菌。本试验中，3种菌种混合发酵饵料的ASP含量明显高于较单一发酵及两两发酵，pH值有所降低，推测出现该现象的原因可能是在发酵过程中产酸含量较高[13]，更大限度地将蛋白质分解为小分子肽（即酸溶蛋白），提高饵料吸收率。马文强等[14]研究发现，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和乳酸菌对豆粕进行混合发酵后，小分子蛋白提高了2.25倍。刘雅娜等[15]使用枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌复合发酵豆粕，发现发酵豆粕的ASP含量较发酵前提高17.47%。本试验中，经过第二阶段发酵发现，各试验组发酵饵料在发酵第5 d的效果最佳。发酵过程中，时间过短会使微生物发酵不完全，时间过长大量微生物生长消耗营养物质降低发酵效率。因此认为3种益生菌对半滑舌鳎配合饵料的最适发酵时间为5 d，时间过短或过长均会影响发酵效果。张亚兰等[13]使用乳酸菌∶酵母菌∶枯草芽孢杆菌为3∶2∶1的比例混合发酵仔猪全价饲料，发现在发酵第3 d达到最佳效果。刘雅娜等[15]使用枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌复合发酵豆粕，发现在第5 d时发酵豆粕的酸溶蛋白达到最大值，最佳发酵比例为5∶2∶2。袁新杰[16]在豆粕中以1∶2∶1的比例接种枯草芽孢杆菌、酵母菌及乳酸菌进行发酵，发现发酵豆粕的ASP含量达到14.68%。王云超等[17]以芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌复合接种棉粕进行固态发酵，得出最优配比为2∶1∶2，此时发酵棉粕的ASP含量由3.46%提高至13.4%。本研究发现，L2组发酵饵料的发酵效果优于其他组，ASP含量比原始全价配合饵料提高了32.6%，且pH值较其他组最低。因此，L2组（即酿酒酵母菌∶枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌=1∶3∶2）为复合菌种最佳发酵组合。本试验发现，发酵饵料组半滑舌鳎的体增重及特定生长率均显著升高，饵料系数有所降低，蛋白质效率也具有一定程度的升高。黄世金等[4]研究发现，投喂发酵饵料罗非鱼的增重率和存活率明显升高，饵料系数下降。丁丽等[3]的研究发现，饲喂益生菌复合发酵饵料可提高异育银鲫增重率及特定生长率。姜燕等[18]发现，投喂发酵饵料试验组刺参的增重率和特定生长率均显著高于未发酵组，生理状态也相对较优。钟小群等[19]使用发酵料投喂鲤鱼幼鱼后，发现鲤鱼的饵料系数显著降低，消化酶及抗氧化酶活性均显著提高。因此，可推测半滑舌鳎配合饵料发酵较鱼粉、豆粕等蛋白源发酵具有高效、便捷的优势。4结论本试验发现，半滑舌鳎全价配合饵料发酵的最适菌种及时间条件为35 ℃下酿酒酵母菌∶枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌以1∶3∶2的比例发酵5 d。发酵饵料可促进半滑舌鳎生长，提高饲料利用率。