抗生素是微生物在生命活动中所产生的一类代谢产物[1]。英国细菌学家弗莱明培养细菌已有90多年的历史[2]。抗生素在低剂量下对微生物有很好的抑制作用，为我国畜牧业带来巨大的经济效益。据统计，2012年我国抗生素原料生产量约为21万t，其中46.1%的抗生素用于畜牧生产[3]。但是，长期使用抗生素对畜产品质量、生态环境和人类健康均产生不良的影响。在家畜生产过程中使用抗生素可以促进动物生长或预防疾病，还可导致人类病原体对抗生素产生耐药性，降低治疗感染的有效性[4]。此外，抗生素会通过动物的排泄进入环境之中，尽管抗生素的半衰期比较短[5]，但是他们的残留物会作为持久性有机污染物留在环境中，对人体造成威胁。Beni等[6]研究表明，地表水系统中存在磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶、林可霉素、红霉素、红霉素和莫能菌素等多种抗生素残留。抗生素能够通过改变肠道微生物群，改变肝脏代谢酶基因表达和肠道吸收相关蛋白质组，提高三嗪类除草剂的生物利用度，增加农药暴露风险[7]。因此，寻找抗生素替代品成为我国饲料行业研究的热点。辣椒碱（又称辣椒素）是辣椒中辛辣味的主要来源。目前已知辣椒素类物质有19种，其中辣椒碱单体（capsaicin，C）、二氢辣椒碱（dihydrocapsaicin，DC）含量最高，约占总辣椒素类物质的90%以上，另外10%左右为高辣椒碱、降二氢辣椒碱等辣椒素类物质[8]。辣椒碱是一种白色晶体粉末，不溶于水易溶于乙醇等有机溶剂，具有抑菌、抗氧化、开胃和镇痛等多种生物学功能[9]。王梦等[10]研究表明，辣椒碱单体、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱以及辣椒素这4种物质都具有抑菌效果，其中辣椒碱单体的抑菌效果最佳。范三红等[11]研究表明，辣椒碱有一定的抗氧化作用。为了进一步了解辣椒碱的抗菌与抗氧化作用，本试验利用体外方法研究辣椒碱对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种鸭源性致病菌的抑菌效果以及对1，1-二苯基-二苦基肼（DPPH）、超氧阴离子和羟自由基的清除能力，为辣椒碱在动物生产中的使用提供试验依据。1材料与方法1.1试验材料辣椒碱（C18H27NO3）由佛山利达尔生物科技公司提供，纯度为90%；鸭源性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均由南京农业大学动物医学院提供；LB液体培养基和固体培养基均购自南京寿德生物科技有限公司。1.2大肠杆菌菌液制备使用接种环取大肠杆菌菌种接种至LB液体培养基中，摇匀后置于37 ℃恒温振荡器中，150 r/min进行活化。12 h后取一环菌液在已灭菌LB固体培养基上进行划线，在37 ℃的恒温箱中培养。24 h后取单株菌落于LB液体培养基中在37 ℃振荡器中，150 r/min培养12 h，然后将活化后的大肠杆菌菌液按照1∶100的比例接种至LB液体培养基中，37 ℃恒温振荡器培养3 h，此时培养基中菌液浓度约为1×108 CFU/mL。最后再使用LB液体培养基对上述菌液稀释至1×105 CFU/mL，置于4 ℃冰箱保存待用。1.3金黄色葡萄球菌和沙门氏菌菌液制备分别取金黄色葡萄球菌和沙门氏菌进行两次传代培养，即先使用接种环分别取金黄色葡萄球菌和沙门氏菌于液体培养基中，37 ℃、150 r/min下摇床培养24 h。向已灭菌的固体培养基中接种一环上述菌液，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，在固体培养基中挑选单个菌落进行划线培养24 h。培养结束后，取单菌落于LB液体培养基中，在37 ℃恒温振荡器中继续培养16 h，此时菌液浓度达到1×108 CFU/mL。使用LB液体培养基稀释菌液，使其浓度约为1×105 CFU/mL，置于4 ℃冰箱中保存备用。1.4最小抑菌浓度（MIC）的测定平板二倍稀释法测定MIC[12]。1.4.1固体培养基的配制称取一定质量的辣椒碱置于锥形瓶中，使用36%的乙醇溶液涡旋溶解。待其完全溶解后加入LB培养基，混匀，分别配置含辣椒碱的浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000和4.000 g/L的培养基并做好标记。以不添加辣椒碱的36%的乙醇培养基作为对照。将配置好的培养基放入高压灭菌锅中，121 ℃灭菌20 min。冷却后倒入平板中，每个浓度设置3个重复，用于接种。1.4.2接种和培养取100 μL“1.2”和“1.3”中制备好的3种菌液均匀涂布在不同浓度梯度的琼脂培养基中。将其置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察每个平板中菌体的生长情况，以无菌体生长的最小辣椒碱含量为辣椒碱对该菌体的最低抑菌浓度。1.5菌体生长曲线的测定采用比浊法测定不同时间点菌液的光密度（OD值），并以培养时间（h）为横坐标，OD值为纵坐标绘制菌体生长曲线[13]。1.5.1液体培养基的配置根据最小抑菌浓度结果配置含辣椒碱浓度为1 g/L（大肠杆菌）和2 g/L（金黄色葡萄球菌和沙门氏菌）的LB液体培养基。每一个菌体准备60只具塞试管，其中30支装入5 mL该菌体所对应的最低抑菌浓度的辣椒碱液体培养基。另外30支装入5 mL含有36%的乙醇液体培养基作为对照。并在试管上做好标记。3个菌体共180支，一并放入高压灭菌锅中，121 ℃灭菌20 min。1.5.2接种、培养和OD值的测定取出“1.2”和“1.3”制备的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌菌液，将50 μL菌液接种于灭菌完成的菌体培养基中，混匀。将全部180支接种完成的试管放置在水浴摇床中，条件设置为37 ℃，150 r/min，开始计时。分别培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h后取出所对应的试管（每个时间点3个重复）。混匀后，在600 nm处测定OD值。以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标分别绘制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生长曲线。1.6抗氧化性能的测定采用相同浓度的抗坏血酸（VC）作为对照来评价辣椒碱的抗氧化能力。1.6.1DPPH清除能力[14]将辣椒碱使用无水乙醇稀释成0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0和2.000 0 g/L不同浓度的辣椒碱使用液。分别吸取不同浓度的辣椒碱使用液0.1 mL于试管中，然后依次加入2.0 mL无水乙醇和0.25 mL的1 mmol/L的DPPH溶液，混匀后室温避光放置30 min，测定517 nm处的吸光度值A样品，同时测得空白A空白（同体积无水乙醇替换样品溶液），每个浓度3次重复。DPPH清除率=(A空白-A样品)A样品×100% (1)1.6.2羟自由清除基能力[15]将辣椒碱使用无水乙醇稀释成0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0和2.000 0 g/L不同浓度的辣椒碱使用液。然后依次加入l.0 mL 9 mmol/L FeSO4、1.0 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇、1.0 mL不同浓度的辣椒碱溶液。加1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2启动反应，混匀后立即在37 ℃水浴锅中水浴30 min，反应结束后在510 nm下测量的吸光度，每个浓度3个重复。羟自由基清除率=A0-AX-AX0A0×100% (2)式中：A0为空白对照液的吸光度值，Ax为加入辣椒碱溶液后的吸光度值，Ax0为不加显色剂H2O2辣椒碱溶液本底的吸光度值。1.6.3超氧阴离子清除能力[16]将辣椒碱使用无水乙醇稀释成0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0和2.000 0 g/L不同浓度的辣椒碱使用液。依次加入1 mLEDTA溶液（l mmol/L，已在25 ℃水浴保温20 min），4.5 mL Tris- HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH值8.2，已在25 ℃水浴保温20 min），1 mL样品液以及0.4 mL邻苯三酚溶液（25 mmol/L），混匀后，在25 °C下水浴保温4 min后，迅速使用l mL HCl（12 mol/L）溶液终止反应。在299 nm处测定其吸光度为A样品，采用l mL无水乙醇代替样品液做对照,吸光度为A空白,每个浓度3次重复[15]。超氧阴离子清除率=(A空白-A样品)A样品×100% (3)2结果与分析2.1辣椒碱对3种鸭源性致病菌的MIC（见表1、图1）由表1、图1可知，在36%乙醇对照组无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌均生长良好。辣椒碱浓度在0.125 g/L至0.5 g/L下，大肠杆菌均能生长，而当辣椒碱浓度≥1.00 g/L时，试验各重复组均无细菌生长（图1a）。金黄色葡萄球菌与沙门氏菌在辣椒碱浓度≥2.00 g/L时生长完全受到抑制（图1b、图1c）。结果表明，在该试验条件下，辣椒碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的MIC分别是1.00、2.00和2.00 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.T001表1不同浓度的辣椒碱对3种致病菌的抑制效果浓度/(g/L)大肠杆菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌对照+/+/++/+/++/+/+0.125+/+/++/+/++/+/+0.250+/+/++/+/++/+/+0.500+/+/++/+/++/+/+1.000-/-/-+/+/++/+/+2.000-/-/--/-/--/-/-4.000-/-/--/-/--/-/-注：“+”表示琼脂培养基上有菌生长，“-”表示琼脂培养基上无菌生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F001图1细菌生长平皿结果2.2辣椒碱对3种致病菌生长曲线的影响（见图2）由图2可知，在0~6 h内大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的OD值均无明显变化，表明细菌生长处于缓慢生长期。在6 h以后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的对照组（36%乙醇）进入快速生长阶段；沙门氏菌的对照组（36%乙醇）则在8 h进入快速生长阶段，OD值迅速增大。而辣椒碱添加组，3种致病菌在培养时间内OD值保持不变或略有增加。结果说明辣椒碱能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌3种致病菌的生长。图2辣椒碱对3种致病菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F002（a）大肠杆菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F003（b）金黄色葡萄球菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F004（c）沙门氏菌2.3辣椒碱抗氧化性能2.3.1辣椒碱和VC对DPPH自由基的清除率（见图3）由图3可知，辣椒碱对DPPH自由基的清除能力随着其质量浓度的升高而提高，对DPPH自由基的清除率最高达92.29%。当浓度为0.062 5 g/L时，VC对DPPH自由基的清除率达57.73%，但是清除率并未随着VC浓度的增加而增加，其清除率相对稳定。因此，当辣椒碱浓度大于0.25 g/L，对DPPH自由基清除率优于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F005图3辣椒碱和VC对DPPH自由基的清除率2.3.2辣椒碱和VC对超氧阴离子的清除率（见图4）由图4可知，在辣椒碱浓度0.062 5 g/L时，辣椒碱对超氧阴离子的清除率为30.54%。随着浓度的增加清除率略有增加，但增加幅度不大。VC随着浓度的增加，溶液中超氧阴离子的清除率增加。当VC浓度0.5 g/L时清除率最高达71.53%。VC对超氧阴离子的清除效果高于辣椒碱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F006图4辣椒碱和VC对超氧阴离子的清除率2.3.3辣椒碱和VC对羟自由基的清除率（见图5）由图5可知，与VC相比，辣椒碱对羟自由基的清除能力低于VC，在1.0 g/L时辣椒碱对羟自由基的清除率达40.6%。而VC浓度为0.5 g/L时，对羟自由基的清除率为92.51%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.001.F007图5辣椒碱和VC对羟自由基的清除能力3讨论辣椒组织可以用于处理由微生物引起不同疾病[17]。辣椒碱则是辣椒果实中的主要活性物质。体外研究表明，辣椒碱对这7种菌种的抑菌作用依次是：金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌啤酒酵母菌葡萄酒酵母黑曲霉青霉[18]。20 mg/L辣椒素能有效抑制戊糖片球菌CICC10196的生长[19]。郭丽[20]测得辣椒素对大肠杆菌与沙门氏菌的MIC为0.813 mg/L与0.103 mg/L。而青辣椒丙酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.75 g/L和0.9 g/L[21]。本试验表明，辣椒碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的MIC分别是1.00、2.00和2.00 g/L。此外，辣椒碱除对病源菌产生抑菌作用外，对植物乳杆菌与肠膜明串珠菌等有益菌也有明显的抑菌效果[22]。Borowski等[23]研究表明辣椒提取物通过阻止细菌的附着与抑制生物膜的形成而达到抑菌目的，对抗抗药细菌的生成。或通过影响细胞膜的流动性，达到抑菌的效果[24]。需氧生物在新陈代谢的过程中会产生超氧自由基、氢氧自由基和脂氧自由基[25]。少量的自由基是维持生命活动所必需的物质，而过量的自由基会直接或间接地发生强氧化作用并产生多种危害。辣椒碱作为一种天然酚类化合物可以结合其他自由基达到抗氧化的效果[26]。体外研究表明，辣椒碱与其主要成分的抗氧化效果依次为：辣椒碱单体＞辣椒素＞二氢辣椒碱单体＞降二氢辣椒碱单体[27]。刘安等[28]研究表明，辣椒碱对DPPH自由基、亚硝基以及羟自由基的清除率随质量浓度的增加而升高，且清除效果与VC基本相近，其中以清除DPPH自由基的效果最佳。体内试验表明，一定剂量辣椒油树脂可以显著降低D-半乳糖致衰模型小鼠机体氧化负荷，增加小鼠的血清、肝脏和脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和总抗氧化能力（TAOC），减少丙二醛（MDA）含量[29]。本试验表明，纯辣椒碱对DPPH、超氧阴离子与羟自由基均具有较好的清除能力，辣椒碱可以作为一种抗氧化剂用于畜牧业生产。4结论通过平板法测得辣椒碱对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为1、2和2 g/L。辣椒碱对DPPH自由基的清除能力要优于VC，但对超氧阴离子和羟自由基的清除能力低于VC。