丁酸梭菌又名酪酸菌，是一种严格厌氧的革兰氏阳性菌，具有产芽孢的特性[1-2]。丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸[3]，可以改善肠道微环境，促进肠道健康[4]。丁酸梭菌可促进畜禽、水产动物肠道有益菌群的增殖[5-6]。丁酸梭菌常用的发酵方式有液体深层发酵[7]与固态发酵[8-9]，由于丁酸梭菌严格厌氧生长，所以工业上以液体深层发酵为主[10]，也可采用混菌发酵方式，通过菌株间的相互协同作用促进丁酸梭菌的快速增殖[11-13]。发酵培养基的组成对丁酸梭菌的生长具有重要影响。目前，均匀试验设计法[14-16]与响应面分析法[17-20]在微生物发酵培养基的优化与模型建立中广泛应用。张超等[21]采用均匀试验设计法对假单胞菌的发酵培养基进行优化，发现L-丝氨酸产量明显提高。夏会丽等[22]利用响应面法对丁酸梭菌发酵培养基进行优化，丁酸梭菌活菌数9.32×108 CFU/mL，提高了2.24倍。但目前很少有研究将这两种方法联用在发酵培养基的优化。因此，本试验采用均匀试验设计方法与响应面分析方法联用优化丁酸梭菌发酵培养基组成，为丁酸梭菌的生产提供参考。1材料与方法1.1菌株丁酸梭菌（Clostridium butyricum LX-2）由本实验室前期筛选得到，保藏于超低温冰箱中。1.2培养基组成活化培养基：葡萄糖10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、蛋白胨10 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、氯化钠3.0 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L，pH值7.0，115 ℃灭菌20 min。增殖培养基使用改良RCM培养基，酵母浸膏3.0 g/L、牛肉浸膏20 g/L、胰蛋白胨15 g/L，葡萄糖2.0 g/L、可溶性淀25 g/L、氯化钠5.0 g/L、三水合乙酸钠3.0 g/L、蔗糖20 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.15 g/L，使用小麦麸皮水煮液（小麦麸皮20 g/L于去离子水中煮沸20 min，四层纱布过滤后使用）溶解以上成分，pH值7.4，115 ℃灭菌20 min。初始发酵培养基：酵母粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸铵1.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、磷酸氢二钾4.0 g/L、碳酸钙2.0 g/L，pH值7.0，115 ℃灭菌20 min。1.3主要试剂葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾、可溶性淀粉、三水合乙酸钠、蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、硫酸亚铁、碳酸钙购自国药集团化学试剂有限公司，胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、牛肉浸膏购自北京双旋微生物培养基制品厂，L-半胱氨酸盐酸盐购自上海麦克林生化科技有限公司。1.4测定指标及方法1.4.1生长曲线将保藏的菌悬液500 μL接入70 mL活化培养基中，34 ℃厌氧培养24 h，作为一级种子液于4 ℃冰箱保存。将一级种子液以5%接种量转接至活化培养基中，34 ℃厌氧培养14 h，作为二级种子液。将二级种子液以5%接种量转接至增殖培养基中，34 ℃厌氧培养10 h，以3%接种量转接至初始发酵培养基，34 ℃厌氧培养，不同时间下测定生物量。1.4.2发酵条件优化该菌株由本实验室前期筛选所得，根据其最适培养条件，将培养温度设置为34 ℃[23]，由于采用静置液体深层发酵，故只针对初始pH值和接种量进行优化。为研究菌株LX-2的最佳发酵初始pH值，使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH控制初始pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），将增殖培养后的菌液以5%接种量转接至初始发酵培养基，34 ℃厌氧培养16 h，测定生物量；为研究菌株LX-2最佳接种量，将增殖培养后的菌液以不同接种量（1%、3%、5%、7%、9%）转接至初始发酵培养基，以上述最佳pH值为初始pH值，34 ℃厌氧培养16 h后测定生物量。1.4.3植物氮源的筛选使用不同种类的植物氮源（麸皮、豆粕、玉米芯粉、玉米浆、米渣、芝麻粕）替代初始培养基中的酵母浸粉，将增殖培养后的菌液以3%的接种量转接至替换后的发酵培养基，34 ℃厌氧培养16 h测定生物量。1.4.4均匀试验设计（见表1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.T001表1混合水平均匀试验设计编号X1/%(m/v)X2/%(m/v)X3/%(m/v)X4/%(m/v)X5/%(m/v)X6/%(m/v)X7/%(v/v)X8/%(m/v)X9/%(m/v)X10/%(m/v)X11/%(m/v)X12/%(m/v)X13/%(m/v)X14/%(m/v)X15/%(m/v)X16/%(m/v)140.20030.100.200.20.40.00500.0150.30.0050.100.15220.20.151.030.050.2000.60.0150.01000.30.0100.150.05340.10.151.540.100.15000.0050.0100.0050.500.200.15430.10.101.530.100.150.60.20.015000.200.050.10530.301.550.200.100.20.40.0050.01500.20.0150.200.10620.10.101.560.100.100.200.0100.0150.0150.30.0050.0507400.200.540.150.0500.40.0100.01000.20.0050.100820.20.20050.150.150000.0050.0050.30.0150.050.109200.10040.100.100.60.600.0100.0100.20.0100.200.10103000.540.050.200.40.20.0050.0150.0050.50.0150.050.051130.10030.200.050.200.0150.0050.0100.50.0100.200.051230.30.200.550.050.150.60.20.0100.0050.0150.200.200.051340.20.101.050.050.050.60000.0050.40.0100.1501420.300.560.100.050.40.60.0100.0100.0050.400.100.1515300.201.060.050.100.20.40.01500.0100.40.0150.150.151640.20.150.560.200.200.60.20.0150.0150.0100.30.0100.100.151720.30.201.030.150.050.40.200.0150.0150.40.0050.150.101820.10.15060.200.150.40.40.005000.50.0050.1501940.30.151.540.150.100.40.60.0100.0050.0100.50.0150.05020300.101.050.200.2000.600.0050.0150.400.100.05通过查阅文献与专利，采用均匀试验设计[24]选出了16种组分，分别为2种碳源[葡萄糖（X1）、淀粉（X2）]，3种氮源[硫酸铵（X3）、蛋白胨（X4）、酵母浸粉（X5）]，2种植物氮源[麸皮（X6）、玉米浆（X7），根据1.4.3中筛选得到]，9种无机盐[磷酸二氢钾（X8）、磷酸氢二钾（X9）、硫酸镁（X10）、硫酸锰（X11）、氯化钙（X12）、氯化钠（X13）、硫酸亚铁（X14）、碳酸钙（X15）、碳酸氢钠（X16）]。通过混合水平均匀试验设计U20（415×3），将增殖培养后的菌液以接种量3%，初始pH值为7.0，34 ℃厌氧培养16 h，测定生物量，每组进行3次平行试验。对试验结果进行二次多项式回归分析，进一步对显著因素进行响应面分析。1.4.5响应面分析对均匀试验设计中的具有正效应和负效应的高度显著性因素进行最陡爬坡试验，以确定其中心点，每组进行3次平行试验。根据最陡爬坡试验结果设计4因素5水平、5个中心试验点、30组试验的中心复合试验，每组进行3次平行试验，中心复合试验设计见表2，试验结果进行响应面分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.T002表2中心复合试验设计因素X1/%X5/%X9/%X12/%-20.651.650.700.009-11.152.650.750.01201.653.650.800.01512.154.650.850.01822.655.650.900.021%1.5生物量测定使用血球计数板测定丁酸梭菌生物量，重复3次测定。1.6数据统计与分析采用DPS数据处理系统V9.50设计混合水平均匀试验，Design Expert 12软件设计中心复合试验并进行响应面分析，SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行差异显著性分析，并使用Origin 2019b软件进行绘图。2结果与分析2.1丁酸梭菌生长曲线与pH值变化结果（见图1）由图1可知，在0~4 h，丁酸梭菌的生物量较低，处于延滞期，主要是由于细胞在新的环境中生长时，需要重新合成必需的酶类，或某些中间代谢产物，以适应新环境，此时细胞不分裂或只有很少分裂。4~14 h时，细胞快速分裂，丁酸梭菌的生物量迅速增长，由0.41×108 CFU/mL快速增长至7.57×108 CFU/mL，此时细胞处于对数生长期，培养基内的营养物质被快速消耗以用于细胞生长分裂。14~18 h时，丁酸梭菌生物量发生明显的下降后，18 h时生物量趋于稳定，约7.47×108 CFU/mL。14~18 h，丁酸梭菌开始合成大量的代谢产物，主要是一些乙酸、丁酸等酸性代谢产物，体系pH值急速下降，16 h时下降至最低值4.64，这些代谢产物可能损伤细胞，菌体细胞出现自溶现象，从而导致丁酸梭菌生物量出现略微下降。研究表明，丁酸梭菌在厌氧条件下，生长特性较一致，通常可在0~16 h内迅速生长，大概24 h时稳定生长[25-26]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.F001图1丁酸梭菌生长曲线与pH值变化结果2.2不同pH值与接种量对丁酸梭菌生物量的影响（见图2）由图2（a）可知，初始pH值为7.0时，丁酸梭菌LX-2生物量最高，达到7.40×108 CFU/mL，而pH值高于或低于7.0，丁酸梭菌生物量均会降低。因此，选择pH值7.0为丁酸梭菌发酵的最佳初始pH值。初始pH值从6.0增加到7.0时，虽然丁酸梭菌总活细胞浓度略有上升，但不同pH值之间无显著差异[27]。这可能是由于培养基组分与菌株生长特性的不同导致。图2不同pH值与接种量对丁酸梭菌生物量的影响注：不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.F2a1（a）不同pH值对丁酸梭菌生物量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.F2a2（b）不同接种量对丁酸梭菌生物量的影响由图2（b）可知，不同的接种量对丁酸梭菌LX-2的生物量也有明显影响，当接种为3%时，丁酸梭菌生物量最高，达到7.46×108 CFU/mL，显著高于其他组（P0.05）。因此选择3%为最佳接种量。2.3不同植物氮源对丁酸梭菌生物量的影响（见图3）植物氮源是一种可再利用的生物资源，作为微生物生长基质的最重要特征之一是不溶性[28]，而梭菌通常具有产生降解植物氮源所需的复杂酶的机制，能够将这些分解的产物用作可发酵底物[2]。也有研究使用丁酸梭菌发酵玉米秸秆生产氢气[29]。由图3可知，酵母浸粉作为氮源添加时，丁酸梭菌LX-2生物量最高，达到7.48×108 CFU/mL，其次是玉米浆和麸皮。虽然添加植物氮源并不能提高丁酸梭菌LX-2的生物量，但其含有多种维生素等多种营养成分，可能在发酵中比精制碳氮源的作用更强。因此在均匀试验设计中选择麸皮与玉米浆作为发酵培养基中的植物氮源进行优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.F003图3不同植物氮源对丁酸梭菌生物量的影响2.4均匀试验及理论最优组合结果（见表3~表5）2.4.1回归分析结果由表3可知，丁酸梭菌 生物量（Y）和各因素间的逐步回归方程为：Y=18.722 6-1.667 8 X1+1.591 3 X4-1.756 X5+13.804 3 X6+5.400 7 X9-157.656 7 X10-114.829 0 X11+212.350 7 X12。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.T003表3均匀试验结果编号丁酸梭菌生物量编号丁酸梭菌生物量113.94±1.321111.62±1.15210.70±0.781211.65±0.6137.92±0.93135.56±0.61414.95±1.37149.87±0.06511.60±0.12158.55±0.5568.47±0.13163.06±0.04710.25±1.211717.31±1.03810.12±0.06188.88±0.86913.21±0.411913.99±0.451010.80±0.432015.25±0.87×108 CFU/mL重复相关系数R=0.940 9，决定系数R2=0.885 3，F=10.609 8，P=0.000 3，剩余标准差=1.360 9，调整后相关系数Ra=0.895 5，调整后决定系数Ra2=0.801 8。由表4可知，X1呈高度显著负相关，X9、X12呈高度显著正相关，X5呈极显著负相关，X4、X6呈显著正相关关系，X10呈显著负相关关系。Durbin-Watson统计量=2.223 9，Durbin-Watson统计量等于2是正态分布，值越接近2，残差越正态分布，表明模型合适，否则模型不合适。由表5可知，拟合误差在2.48内，表明回归方程拟合准确性高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.T004表4回归方程的响应值和变量之间的偏相关分析结果项目偏相关t值P值显著性r（Y，X1）-0.834 34.393 80.002 1**r（Y，X4）0.700 52.949 00.019 3*r（Y，X5）-0.945 06.632 00.000 1***r（Y，X6）0.642 02.623 60.034 8*r（Y，X9）0.791 34.298 40.002 1**r（Y，X10）-0.669 73.065 00.016 5*r（Y，X11）-0.541 72.066 80.092 7r（Y，X12）0.774 13.675 20.006 4**注：“***”为差异极显著（P0.001），“**”为差异高度显著（P0.01），“*”为差异显著（P0.05），表10与此同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.T005表5回归方程的拟合值与试验值的对比结果编号观察值拟合值拟合误差113.940 012.842 40.176 4210.700 012.715 0-2.483 237.920 08.648 1-1.210 2414.950 012.521 91.507 4511.600 010.838 00.814 168.470 08.164 8-0.048 2710.250 07.914 51.195 5810.120 010.107 00.240 8913.210013.905 1-0.420 91010.800 09.139 21.644 71111.620 010.565 9-0.409 91211.650 08.975 81.500 1135.560 07.202 3-1.513 7149.870 09.429 10.819 7158.550 08.814 00.100 7163.060 04.439 5-1.393 01717.310 017.419 80.065 4188.880 09.845 0-0.412 51913.990 013.687 80.298 32015.250 015.636 2-0.545 22.4.2理论最优组合结果由于因素个数过多，因此采用二次多项式逐步回归分析极大值，寻求理论最优组合，回归方程为Y=13.406-0.540 X1X4-0.369 X1X5+0.178 X1X7-174.670 X2X14+1.524 X3X8-1.248 X4X5+62.059 X4X6-21.218 X4X10+21.816 X4X14+5.964 X5X7+0.008 X5X8+0.501 X5X13-252.742 X6X7+0.065 X7X11-0.691 X8X15+500.715 X9X12-1448.968 X11X16+293.218 X12X13，调整决定系数Ra2=0.999 9。最优结果为葡萄糖3.15%、淀粉0.34%、硫酸铵0%、蛋白胨2.05%、酵母浸粉2.65%、麸皮0.23%、玉米浆0.21%、磷酸二氢钾0.64%、磷酸氢二钾0.65%、硫酸镁0.006%、硫酸锰0.001 5%、氯化钙0.006%、氯化钠0.52%、硫酸亚铁0.018%、碳酸钙0.42%、碳酸氢钠0%，理论最优丁酸梭菌生物量为17.98×108 CFU/mL，经验证，丁酸梭菌生物量为17.47×108 CFU/mL，与理论值相比，误差百分比为2.836%，回归方程拟合准确度高，结果准确可靠。2.5响应面试验分析结果2.5.1最陡爬坡试验结果（见表6）选择均匀试验设计结果中具有显著性、高度显著和极显著的4种组分，即X1、X5、X9、X12进行响应面分析，结果见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.T006表6最陡爬坡试验结果编号X1/%X5/%X9/%X12/%丁酸梭菌生物量/(×108 CFU/mL)13.1506.6500.6500.00613.850±0.24022.6505.6500.7000.00911.770±0.34032.1504.6500.7500.01213.830±0.31041.6503.6500.8000.01518.270±0.79051.1502.6500.8500.01812.280±0.83060.6501.6500.9000.02112.170±0.690由表6可知，当培养基中葡萄糖1.650%、酵母浸粉3.650%、磷酸氢二钾0.800%、氯化钙0.015%时，丁酸梭菌生物量最高。因此，以此组合为中心点设计中心复合试验。2.5.2中心复合设计试验设计结果（见表7）由表7可知，根据对中心复合试验结果进行回归分析，建立回归方程为：Y（×108）=11.41 +0.54 X1-3.01 X5-0.94 X9-0.69 X12+0.21 X1X5+0.81 X1X9-0.56 X1X12+0.71 X5X9-0.68 X5X12+0.21 X9X12+0.14（X1）2-0.40（X5）2-0.52（X9）2+0.18（X12）2-0.21 X1X5X9+0.007X1X5X12+0.59 X1X9X12+0.46X5X9X12+1.55（X1）2X5+0.16（X1）2X9+0.91（X1）2X12-1.53X1（X5）2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.T007表7中心复合试验设计结果编号X1/%X5/%X9/%X12/%丁酸梭菌生物量/(×108 CFU/mL)11.6501.6500.8000.01515.700±1.60022.1504.6500.8500.0129.100±1.80032.1504.6500.8500.0189.200±0.90041.1502.6500.7500.01818.560±0.88051.6505.6500.8000.0153.650±0.52061.6503.6500.8000.01512.900±1.43071.6503.6500.8000.01511.900±1.30082.1504.6500.7500.01210.150±1.04092.6503.6500.8000.01512.940±0.800101.6503.6500.8000.01511.650±1.060111.6503.6500.8000.02110.650±0.040121.6503.6500.8000.01510.560±0.720131.1504.6500.8500.0129.150±0.290142.1504.6500.7500.0186.050±0.740151.1502.6500.8500.01210.600±0.640161.6503.6500.8000.00913.400±1.410170.6503.6500.8000.01510.800±0.540181.1502.6500.7500.01213.550±1.190192.1502.6500.8500.0129.800±0.650202.1502.6500.8500.01811.550±0.450211.6503.6500.7000.01511.100±0.140222.1502.6500.7500.01811.400±0.020231.1504.6500.8500.0189.900±0.840241.6503.6500.8000.01510.650±0.140251.1504.6500.7500.01211.050±1.310262.1502.6500.7500.01211.800±0.100271.1502.6500.8500.01811.450±0.860281.1504.6500.7500.01810.700±0.350291.6503.6500.9000.0157.350±0.170301.6503.6500.8000.01510.800±0.310回归方程的方差分析结果见表8。由表8可知，回归模型的P值小于0.01，说明模型具有高度显著性，相关系数R=0.975 9，失拟项P值不显著，X9的P值均小于0.05，X5的P值小于0.001，表明酵母浸粉与磷酸氢二钾对生物量的影响呈显著性，且酵母浸粉的影响更显著。X1X9、X1X12、X5X9、X5X12的P值均小于0.05，表明因素之间的交互作用影响显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.T008表8回归方程的方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型202.560 0229.210 012.890 00.001 0**X12.290 012.290 03.210 00.116 5X572.600 0172.600 0101.620 00.000 1***X97.030 017.030 09.840 00.016 4*X123.780 013.780 05.290 00.054 9X1X50.684 810.684 80.958 50.360 2X1X910.580 0110.580 014.810 00.006 3**X1X124.960 014.960 06.950 00.033 6*X5X97.990 017.990 011.190 00.012 3*X5X127.300 017.300 010.220 00.015 1*X9X120.676 510.676 50.946 90.362 9X120.572 610.572 60.801 40.400 4X524.480 014.480 06.270 00.040 7*X927.320 017.320 010.250 00.015 0*X1220.920 910.920 91.290 00.293 6X1X5X90.726 810.726 81.020 00.346 7X1X5X120.000 810.000 80.001 10.975 0X1X9X125.530 015.530 07.750 00.027 2*X5X9X123.340 013.340 04.670 00.067 4X12 X512.800 0112.800 017.920 00.003 9**X12X90.129 210.129 20.180 80.683 4X12X124.450 014.450 06.220 00.041 3*X1X5212.470 0112.470 017.460 00.004 1**残差5.000 070.714 4失拟项0.810 920.405 40.483 80.642 6不显著纯误差4.190 050.838 0总离差207.570 0注：R²=97.59%，R²Adj=90.00%。根据回归模型进一步分析两因素交互作用对丁酸梭菌生物量具有显著影响的结果，其响应曲线与等高线图见图4。图4各因素交互作用对丁酸梭菌生物量影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.F4a1（a）葡萄糖与磷酸氢二钾对丁酸梭菌生物量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.F4a2（b）葡萄糖与氯化钙对丁酸梭菌生物量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.F4a3（c）酵母浸粉与磷酸氢二钾对丁酸梭菌生物量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.015.F4a4（d）酵母浸粉与氯化钙对丁酸梭菌生物量的影响由图4可知，当磷酸氢二钾添加量不变时，随着葡萄糖含量增加，丁酸梭菌生物量出现先增大后减小的趋势，且当葡萄糖含量为1.15%左右时，其生物量达到最高，表明过高的葡萄糖含量可能会抑制丁酸梭菌生长。当磷酸氢二钾与氯化钙含量不变时，随着酵母浸粉含量增加，丁酸梭菌生物量均出现先增大后减小的趋势。氯化钙处于较低水平时，随着葡萄糖含量增加，生物量呈先增大后减小的趋势；而氯化钙处于较高水平时，随着葡萄糖含量的降低，丁酸梭菌生物量逐渐增大。当葡萄糖含量为0.65%左右时，丁酸梭菌生物量达到最高点。2.5.3验证试验结果响应面分析结果显示，丁酸梭菌生物量达到最大时，4个因素的取值为葡萄糖1.15%、酵母浸粉2.65%、磷酸氢二钾0.75%、氯化钙0.018%，得到理论最优值为18.3×108 CFU/mL。为了验证此模型预测的准确性，对优化后的培养基进行了验证，共进行3次试验，其平均值为18.1×108 CFU/mL，实测值与回归方程预测值相对误差为1.10%。因此，使用该回归模预测可行，且具有实用价值。最终优化后丁酸梭菌发酵培养基为：葡萄糖1.15%、淀粉0.34%、蛋白胨2.05%、酵母浸粉2.65%、麸皮0.23%、玉米浆0.21%、磷酸二氢钾0.64%、磷酸氢二钾0.75%、硫酸镁0.006%、硫酸锰0.0015%、氯化钙0.018%、氯化钠0.52%、硫酸亚铁0.018%、碳酸钙0.42%。3结论本研究对丁酸梭菌培养条件进行优化，采用均匀试验设计对16种培养基组分进行了优化筛选，得到了对丁酸梭菌生物量具有高度显著性影响的组分为葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、氯化钙。利用响应面法分析确定丁酸梭菌最佳发酵培养基成分为葡萄糖1.15%、淀粉0.34%、蛋白胨2.05%、酵母浸粉2.65%、麸皮0.23%、玉米浆0.21%、磷酸二氢钾0.64%、磷酸氢二钾0.75%、硫酸镁0.006%、硫酸锰0.001 5%、氯化钙0.018%、氯化钠0.52%、硫酸亚铁0.018%、碳酸钙0.42%，丁酸梭菌菌体数达18.1×108 CFU/mL，比初始发酵培养基提高了2.42倍。结果表明，两种方法联用优化丁酸梭菌发酵培养基的效果良好。