多组学技术在生物体内应用遵循育种学“中心法则”，包括基因组（Genomes）、转录组学（Transcriptomes）、蛋白组质学（Proteomics）、代谢组学（Metabolomics）[1]。这些组学标记和技术的一个显著特点是以多路、并行的方式运行，特定的标志物可被选择用于特定的应用或用途。自20世纪90年代起，转录组成为生物学领域内的研究热点，可为蛋白质组研究提供基础，弥补蛋白质组无法清晰鉴定基因功能。随着非编码区的相关研究不断深入，可转录组的研究范围也在逐渐扩大，新一代高通量测序技术的应用也扩大了利用转录组解决实际问题的范围。探究转录组学在畜禽养殖领域的应用将会成为未来研究热点，基于此，本文对转录组学作用机制及其在绵羊和山羊繁殖领域的应用进行论述，以期为养羊业发展及进一步改善绵羊和山羊生产性能提供参考。1转录组学研究概况根据中心法则，mRNA是一个桥梁，可将DNA转化成蛋白质。转录组学可调控细胞内基因表达，达到定位注释每个基因结构和功能，为畜禽疾病诊疗以及畜禽新品种改良提供技术支持[2]。转录组是一类探究畜禽细胞内所有转录产物的集合。哺乳动物转录组主要由核糖体RNA（80%，rRNA）、转移RNA（15%，tRNA）、mRNA（24%）和少量的非编码RNA（1%，lncRNA）组成[3]。关于多聚腺苷酸（poly A+）和非多聚腺苷酸（poly A）RNA的组成存在不同的报道[3]。此外，还存在一些长非编码RNAs（lncRNAs）以及小非编码RNA（miRNA）[4]。1.1转录组学检测技术同一生物个体处于不同生理阶段以及生长环境下，转录组处于动态变化阶段[3]。由于转录组的动态变化，一些学者开始将目光转向RNA的表观转录组学。表观转录组学是近年来新兴的一种mRNA的化学修饰对基因表达的检测技术。有研究针对表观转录组对mRNA上的化学修饰进行了总结，目前mRNA上鉴别出8种化学修饰，并对m 1A、Ψ和m6Am化学修饰进行论述[5]，见图1[3]。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.021.F001图1mRNA常见的化学修饰Fig.1Common chemical modifications of mRNA1.2转录组学常用测定方法转录组学是一门寻求测量RNA水平随时间的波动情况以及对各种波动反应的学科。转录本处理和降解的速率以及其他转录后过程创造了细胞功能所必需的动态环境。最常用的方法是基因芯片技术，过程包括提取样品RNA、荧光标结核苷酸、反转录成cDNA、将标记的核苷酸序列与探针杂交、经检测杂交信号而获取细胞基因表达信息。RNA测序技术流程为：mRNA小片段、cDNA、PCR扩增、图像识别和DNA序列。1.3转录组测序技术优点转录组测序技术是一种深度测序技术，具有3个优点：首先，转录组测序技术不仅能够检测现有基因组序列相对应的转录本，还可检测尚未知基因组序列的生物，从而揭示转录组界限的确切位置。转录组测序技术对30 bp短序列提供了两个外显子的连接信息，而长序列或对端短序列揭示了多个外显子之间的连接。上述因素使转录组测序技术对研究复杂的转录组具有非常重要的作用。此外，转录组测序技术还可揭示转录区域的序列变异[6]。转录组测序技术没有定量上限，这与获得的序列数量有关。因此，转录组测序技术的动态表达范围很大。转录组测序技术具有高度准确的定量表达水平，其结果无论是技术复制还是生物复制均显示了高水平的重复性。综合上述优点，转录组测序技术是第一种基于测序的方法，以高通量和高定量的方式对整个转录组进行分析测定[6]。2非编码RNA在细胞内作用机制2.1miRNAs的作用机制大部分miRNA基因被RNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）转录为多顺反子，而小群体则依赖RNA Pol Ⅲ。转录导致大的前体（pri-miRNA）表现出miRNA样修饰，包括5个“帽子”和3个polyA，其特征是一个发夹结构覆成熟的miRNA序列。通过核复合体介导，该复合体包括DGCR8蛋白，能够识别primiRNA，并通过RNAse Ⅲ内切酶Drosha指导切割，由此产生的60个核苷酸的pre-miRNA由Exportin-5和RAN-GTP介导从细胞核转位到细胞质。之后RNase Ⅲ核酸内切酶Dicer与TAR RNA结合蛋白（TAR BP）相互作用，切割靠近末端环的前体，释放22个核苷酸的RNA双链。miRNA双链复合体（miRISC）与Ago蛋白（Argonaute）相结合，成熟的miRNA（导链）保留在复合物中，而双链的另一链（miRNA）被降解。miRNA被转录为较长的前体或由内含子衍生，并通过内核溶解过程成熟[7]。成熟的miRNA被收入RNA诱导的复合体（RISC），通过降解或翻译抑制调控靶转录本的表达。非编码RNA（lncRNAs）可分泌到细胞外空间，与囊泡或蛋白质稳定结合，作用机制见图2[7]。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.021.F002图2miRNAs的作用机制Fig.2Mechanism of action of miRNAs2.2lncRNA的作用机制lncRNA可分为几种类型：增强子RNA、基因间异质性转录产物以及正转录产物或反转录产物。lncRNA依靠Watson-Crick碱基配对原则，分别与mRNA、miRNA或DNA等其他RNA分子相互作用；二级结构包括螺旋、发夹环、突起和假结，均由碱基对或核糖主链的相互作用形成，从而形成高阶构型；在许多情况下，RNA的结构决定其功能，而非原序列。截至目前，三维RNA结构被更多地应用于包括核糖体或剪接体成分在内的核酶，而不是lncRNA；虽然lncRNA被认为比其蛋白质编码的同类更具有结构性，但其结构上的多功能性可能发挥了关键作用，使lncRNA与其他RNA分子、DNA和蛋白质相互作用，从而形成结合位点[7]。2.3CircRNAs的作用机制CircRNAs在真核生物中非常丰富，并且对某些细胞类型或发育阶段具有特异性。CircRNAs通常将基因中外显子或内含子剪接成环状[8]。外显子CircRNAs依赖剪接体剪接，可通过反向剪接的过程产生，外显子以相反的顺序进行拼接，将上游的3个剪接位点与下游的5个剪接位点连接起来，形成循环产物[9-11]。在另一种机制中，外显子CircRNAs由外显子跳过形成的套索结构，其中包含外显子和内含子[12-13]。该前体经历了自我剪接，而内含子被移除，套索最后被环化[14]。3转录组学在羊繁殖方面应用的研究RNA测序技术广泛应用于绵羊和山羊繁殖领域，目的是筛选影响绵羊和山羊繁殖性能的基因。RNA测序技术针对不同生长阶段绵羊和山羊卵巢组织进行测序，以鉴定各种编码/非编码RNA，明确其在机体内的生物学功能[15]。3.1转录组学在绵羊繁殖方面的应用研究miRNAs属于内源性非编码RNA，已成为转录后的重要调控因子；对于绵羊来说，卵巢生物学在不同季节存在明显的差异[16]。比较不同发情阶段母羊卵巢中小RNA的表达谱（黄体期、发情前期和发情期），然后对差异表达miRNAs的靶基因进行KEGG Pathway分析，分析了生殖相关通路中miRNA及其靶基因表达的相关性。高通量测序技术用于miRNAs的鉴定，在各种动植物的小RNA测序中具有更特殊的优势，具有高通量、高重复性和高准确性。与传统方法相比，高通量测序技术在发现具有特定功能的新型miRNA方面具有特殊优势[17]。对空怀期绵羊卵巢miRNA谱进行了研究，在羊卵巢中共鉴定出483个miRNA。在不同生殖阶段，miRNA的表达模式不同。结合通路富集分析、靶基因表达和激素测定结果可知，这些在发情过程中差异表达的miRNAs通过调节激素分泌和生殖发育相关的通路参与了卵巢活性的衰减，上述miRNAs在季节性发情调控中的作用并为识别可能用于调节绵羊季节性发情的miRNAs提供了候选基因[16]。石田培等[18]对不同时间段绵羊背部最长肌进行全转录组测序，结果表明，随着胚胎日龄的增长，circRNA特异性表达更多，找到多个控制快慢机转换的核心转录因子。林嘉鹏[19]研究表明，激素处理对羔羊和母羊miRNA表达产生抑制作用；同时进行IPA软件、荧光定量PCR以及蛋白质组学分析，得出促卵泡素可能通过影响卵巢颗粒细胞中miRNA表达量进而影响卵泡发育。谷博[20]探究不同月龄小尾寒羊卵巢组织中miRNA表达量，结果表明，各阶段小尾寒羊卵巢中miRNA表达个数差异不明显，确定了miRNA的3个靶向基因：oar-miR-432、RPS6KA1及oar-miR-143。Di等[16]研究表明，在小尾寒羊卵巢中共鉴定出483个miRNAs，包括97个已知的miRNAs、369个稳定的miRNAs和17个新miRNAs；根据已建立的miRNA家族系统，上述miRNA被划分为183个miRNA家族。miRNA家族大小从1到21个不等，其中123个（67%）miRNA家族有一个成员，33个（18%）有两个成员，mir-154和mir-2284家族成员最多。值得注意的是，同一miRNA家族的不同成员可能表现出显著不同的表达水平。FecB是BMPR IB在A746G位点上的一个突变点，可导致从谷氨酰胺到精氨酸的氨基酸突变。基于FecB突变的影响可显著增加排卵和产仔数[21]。祁云霞等[22]研究发现了37个miRNAs在绵羊卵巢中特异性表达，双卵巢中miRNAs差异性表达，表明双羔优于单羔。Zhang等[21]研究按照卵泡不同发育周期以及不同单胎产仔数，将试验羊分为4组：卵泡期多胎绵羊、卵泡期单胎绵羊、黄体期多胎绵羊以及黄体期单胎绵羊。分别取各组小尾寒羊的下丘脑，FecB基因“++”通过RNA测序（RNA- seq）检测绵羊下丘脑中的lncRNA，鉴定了一些已知和新的lncRNA。其中在卵泡期多胎绵羊、卵泡期单胎绵羊、黄体期多胎绵羊以及黄体期单胎绵羊的卵泡中发现了多个差异表达；之后分别采用GO和KEGG富集分析预测靶细胞基因，黄体期多胎绵羊对黄体期单胎绵羊中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解现象，以及卵泡期多胎绵羊对缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成现象。lncRNA及其靶标的相互作用体表明：MSTRG.26777及其顺式靶标ENSOARG00000013744、ENSOARG0000001370、ENSOA-RG00000013777和MSTRG.105228及其靶标WNT7A可能在下丘脑中参与绵羊的繁殖过程[21]。3.2转录组学在山羊繁殖方面的应用研究有研究在山羊卵巢中发现了许多miRNA[16]，其中circRNAs是一种新型的非编码RNA，具有一个封闭的连续循环，5'-3'极性连接在一起。具体来说是通过一个反向剪接形成，其中上游的剪接受体与下游的剪接供体连接。circRNAs表现出更强的稳定性，在哺乳动物细胞中比miRNA和lncRNA更保守，已被证实与生物过程中的基因表达调控有关。深度RNA测序（RNA-seq）检测了麻城黑山羊和波尔山羊排卵前卵泡样品中差异表达的circRNA，在山羊身上首次发现了数百个新的circRNA。麻城山羊和波尔山羊在排卵前卵泡衍生的环状RNA中有37个差异表达，通过qRT-PCR验证环状RNA的表达模式。采用GO和KEGG两种方法分析，结果表明，大量靶基因参与了卵巢类固醇生成通路的生物调控和再生。随后利用生物信息学方法构建环状RNA-miRNA-mRNA网络，通过荧光素酶活性测定，chi-circ0008219被证实可检测到3个卵泡相关的miRNAs。综上所述，RNA的差异表达可能影响山羊卵巢卵泡的发育[23]。赵智峰等[24]研究表明，在川中黑山羊与雷州山羊卵泡中共有基因中发现3种可能影响山羊繁殖性能的基因，为GADD45B、TC2N和MSMO1。Pitia等[25]研究表明，INSL3基因通过HE染色方式调控公羊繁殖能力，且基因表达水平与繁殖能力成正比。韩聪[26]研究记录1~3月龄陕北白绒公山羊睾丸中lncRNA基因的差异性表达，得出睾丸中生精细胞可能由lncRNA调控的结论。综上所述，一些专家学者已经从转录组学角度分析绵羊或山羊繁殖形状相关基因的作用机制，形成了从候选基因到miRNA到LncRNA到circRNA的调控网络，为更多研究学者提供研究方向。4结论转录组学是在RNA水平上研究基因表达的情况，通过构建cDNA库进行基因表达序列分析，利用DNAchip比较不同的转录组进行大规模测序。该技术能够揭示不同个体、不同细胞、不同发育阶段以及不同生理病理状态下基因表达信息，该技术不仅可以应用于绵羊和山羊繁殖领域，也可以应用于绵羊和山羊培养瘤胃微生物的研究提供新的思路。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.021.F003