猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一。目前发现PCV有4个血清型，即猪圆环病毒Ⅰ型（PCV1）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）、猪圆环病毒Ⅲ型（PCV3）和猪圆环病毒Ⅳ型（PCV4）。PCV2为致病性的病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原[1]。随着养殖业快速发展，PCV2病毒已在全球范围内广泛传播，通过水平传播和垂直传播两种方式在猪群中流行，对猪群造成持续性危害[2]，造成了巨大的经济损失。黄酮类化合物是一类存在于天然物质中具有酚类结构的化合物，属于植物次生代谢产物[3]。大量研究表明，黄酮类化合物具有抗炎、抗过敏、抗氧化及抗癌等特性[4-5]。辣蓼的主要化学成分有黄酮类、挥发油、糅质类等，其中黄酮类化合物具有生物抗氧化性、清除自由基、杀虫等多种生物活性[6]。辣蓼黄酮主要含有芦丁、槲皮素和槲皮苷等物质[7-8]。槲皮苷（quercitrin，QUE）具有多种治疗作用，包括抗心脑血管疾病、免疫调节、神经保护、调节血脂及抗氧化等[9]。有研究结果显示，QUE具有抗过敏作用，可减轻特应性皮炎[10]。董金叶等[11]发现，QUE可以通过减少吞噬细胞的数量减轻局部炎症细胞浸润，进一步减轻小鼠变应性鼻炎的症状。Kim等[12]发现，QUE通过刺激NADPH的产生和线粒体膜电位增强真皮乳头细胞中的细胞活力和能量代谢，促进头发生长。Tang等[13]发现，QUE可以抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症和氧化应激。目前PCV2流行毒株变异较快，尚无较好的方法能够完全控制该病的发生。本试验采用中性红法测定QUE对3D4/2细胞吞噬活性的影响以及QUE对感染PCV2的3D4/2细胞吞噬活性的影响，确定QUE能否提高3D4/2细胞的吞噬活性，并对其产生保护作用。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验试剂QUE（纯度98%）购自北京索莱宝科技有限公司，DMEM粉末高糖培养基、胎牛血清购自Gibco公司，青霉素、链霉素混合液（100×）、L-Glutamine、PBS缓冲液、二甲基亚砜（DMSO）、中性红粉末购自索莱宝公司，胰蛋白酶EDTA溶液购自BI公司。1.1.2试验仪器多功能微孔板检测仪（瑞士TECAN公司）、荧光细胞计数分析仪（美国NEXCELOM公司）、二氧化碳培养箱（德国BINDER公司）、TS100-F倒置显微镜（日本Nikon公司）。1.1.3病毒和细胞PCV2毒株由南京农业大学动物疫病诊断与免疫实验室馈赠，由本实验室在PK-15细胞上进行扩增培养获得病毒液，根据Reed-Muench方法测量其病毒滴度（TCID50）为10-5/0.1 mL。猪肺泡巨噬细胞系3D4/2细胞来自武汉大学细胞库，由本实验室扩增培养获得，定期复苏细胞保存活力，并于液氮中冻存。1.2试验方法1.2.1QUE 对3D4/2细胞吞噬活性的影响将生长状态良好的3D4/2细胞用10%-FBS-DMEM培养液调整浓度至1×105个/mL细胞悬液，按照100 μL/孔接种于96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中孵育2 h。待细胞长至单层后取出96孔板，弃去培养液，按照100 μL/孔加入新鲜的2.5%-FBS-DMEM完全培养液，置于细胞培养箱中培养12 h。试验设置细胞对照组、0.05% DMSO组和不同浓度的QUE药物组（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μmol/L，以2.5%-FBS-DMEM培养液稀释），每组6个重复。细胞对照组、0.05% DMSO组每孔加入200 μL 2.5% FBS-DMEM培养液，药物组每孔加入200 μL不同浓度的槲皮苷，置于细胞培养箱中培养36 h。培养结束前1 h，弃掉培养液，PBS洗涤细胞，每孔分别加入0.072%中性红溶液100 μL，置于细胞培养箱中作用1 h。取出96孔细胞培养板，弃掉中性红溶液，加入PBS 缓冲液洗涤细胞，吸取150 μL细胞裂解液分别加入每孔中，混匀后置于细胞培养箱中继续培养1 h，在酶标仪540 nm处下测定OD值，计算细胞吞噬指数。吞噬指数=（处理组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）×100%（1）1.2.2QUE对PCV2感染3D4/2细胞吞噬活性的影响试验设置为细胞对照组、0.05% DMSO组、PCV2阳性对照组和不同浓度的QUE药物组（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、 400.0 μmol/L，含2.5%-FBS-DMEM培养液稀释），每组6个重复。细胞对照组、0.05% DMSO组每孔加入100 µL无血清的DMEM培养液，PCV2阳性对照组和不同浓度QUE组加入PCV2（感染复数MOI=1）病毒液100 μL孵育2 h，用无菌PBS洗涤后，细胞对照组和对照组每孔分别加入200 μL含2.5%-FBS-DMEM培养液，QUE组每孔加入200 μL不同浓度的QUE溶液，放入培养箱中继续孵育培养36 h。按照1.2.1中的中性红法测定其OD值，并计算吞噬指数。1.3数据处理与分析试验数据采用SPSS statistics 23软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1QUE对3D4/2细胞吞噬活性的影响（见表1）由表1可知，与对照组相比，0.05% DMSO组、12.5 μmol/L QUE组对3D4/2细胞吞噬指数无显著增强作用（P0.05）；25.0、50.0 μmol/L的QUE处理后显著提高了3D4/2细胞的吞噬指数（P0.05）；经100.0~400.0 μmol/L的QUE处理后极显著提高3D4/2细胞的吞噬指数（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.001.T001表1QUE对3D4/2细胞吞噬指数的影响Tab.1Effect of QUE on 3D4/2 cell phagocytosis index组别细胞吞噬指数对照组100.000 0±6.137 50.05% DMSO组103.240 0±2.404 8QUE 12.5 μmol/L组101.920 0±3.664 7QUE 25.0 μmol/L组104.530 0±4.360 3*QUE 50.0 μmol/L组105.290 0±2.892 4*QUE 100.0 μmol/L组106.470 0±3.787 0**QUE 200.0 μmol/L组108.180 0±1.871 2**QUE 400.0 μmol/L组108.640 0±3.256 0**注 ：*表示与对照组相比差异显著（P0.05），**表示与对照组相比差异极显著（P0.01）；下表同。%2.2QUE对PCV2感染3D4/2细胞吞噬活性的影响（见表2）由表2可知，PCV2感染3D4/2细胞36 h后略下调细胞的吞噬指数，但与细胞对照组相比差异不显著（P0.05）；含有0.05% DMSO的溶剂对细胞吞噬指数也无显著影响（P0.05）。与PCV2阳性对照组相比，不同浓度的QUE（12.5~400.0 μmol/L）处理36 h后均能够极显著提高PCV2感染3D4/2细胞的吞噬指数（P0.01）。与对照组相比，100、200、400 μmol/L的QUE极显著提高细胞吞噬指数（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.001.T002表2QUE对PCV2感染3D4/2细胞吞噬指数的影响Tab.2Effect of QUE on phagocytic index of PCV2-infected 3D4/2 cells组别细胞吞噬指数对照组100.000 0±1.456 60.05% DMSO组100.540 0±1.353 1QUE 12.5 μmol/L组101.830 0±0.650 5*##QUE 25.0 μmol/L组102.120 0±0.691 6*##QUE 50.0 μmol/L组102.060 0±1.024 0*##QUE 100.0 μmol/L组102.870 0±2.226 9**##QUE 200.0 μmol/L组103.190 0±1.351 4**##QUE 400.0 μmol/L组103.260 0±2.210 4**##PCV2阳性对照组99.340 0±1.702 2注 ：#表示与PCV2阳性对照组相比差异显著（P0.05），##表示与PCV2阳性对照组相比差异极显著（P0.01）。%3讨论黄酮类化合物广泛存在于自然界中，属植物次生代谢产物，对细胞吞噬活性有一定影响，具有免疫调节作用。巨噬细胞的吞噬功能使其具有清除自身衰老细胞、杀灭外源性抗原及抗原提呈等作用[14]。巨噬细胞是一把双刃剑，在多种疾病中具有双重作用，是促发先天免疫的炎症反应的主要介质，通过分化、极化、激活等方式，对多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的发病机制起到决定性作用[15]。PCV2通过口鼻腔、呼吸道等途径感染天然宿主（家猪和野猪），病毒在宿主体内持续性复制增殖，诱导具有免疫抑制作用的细胞因子表达，进一步降低宿主细胞非特异性免疫功能，严重侵害患猪的免疫系统，形成免疫抑制。猪肺泡巨噬细胞通常被认为是PCV2感染的重要靶细胞，是机体免疫系统抵御有害物质的第一道防线。吞噬活性增强是肺泡巨噬细胞活化的典型特征，也是衡量机体免疫功能强弱的重要指标。中性红法常用于检测免疫细胞的胞饮吞噬能力，其细胞数量的多少决定中性红的积累，与细胞胞饮吞噬活性呈正相关。研究发现，大多数黄酮类化合物均可以促进巨噬细胞的吞噬作用，增强细胞的免疫功能[16-18]。苦荞糠皮总黄酮可使小鼠吞噬细胞的吞噬能力增强，且吞噬指数呈剂量依赖性增加[19]。杨秀松[20]发现，金花葵粗黄酮提取物可以增强小鼠巨噬细胞的吞噬百分率、单核吞噬细胞的吞噬指数。橙皮素衍生物通过增强巨噬细胞的吞噬作用，促进一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的释放，同时上调Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表达增强免疫力，从而参与免疫反应[21]。上述结论与本试验中QUE增强巨噬细胞吞噬活性的结果相一致。本研究通过中性红试验检测3D4/2细胞吞噬活性，结果表明，DMSO溶剂、12.5 μmol/L QUE对细胞吞噬指数无显著作用，即对吞噬活性无影响；25.0~400.0 μmol/L的QUE显著提高细胞的吞噬指数，即增强其吞噬活性；12.5~400.0 μmol/L的QUE均能极显著提高PCV2感染3D4/2细胞的吞噬指数，即对其吞噬活性具有明显的增强作用，且吞噬活性随着药物浓度升高而增强。综上所述，QUE能够促进猪肺泡巨噬细胞的吞噬活性，并具有一定的保护作用，可增强细胞的免疫活性。4结论本研究结果显示，QUE可以显著提高3D4/2细胞吞噬中性红染料的能力，即QUE提高3D4/2细胞的吞噬活性，表明QUE对3D4/2细胞具有一定的保护作用与免疫调节作用，对其吞噬活性具有良好的促进作用。