猪链球菌病是生猪养殖过程中较为常见的一类传染性疾病，导致其发病的病原菌为猪链球菌。猪链球菌为革兰氏阳性菌，在血平板培养基上可产生溶血环，呈圆形或椭圆形菌落[1]，时常与其他病原微生物混合感染，临床防控较为困难，对我国猪养殖业造成了严重的经济损失[2-4]。猪链球菌病在20世纪后期发病严重，在我国河北、河南等地区均呈地方性流行、大面积暴发[5-6]。猪链球菌主要通过呼吸道、消化道、伤口等途径传播流行，感染后主要寄居在扁桃体内，患病猪的体液、内脏等均存在大量链球菌[7]。猪感染后链球菌会导致脑膜炎等疾病，甚至使母猪流产，人感染后可能患败血症，出现腹泻、腹痛等症状[8]。链球菌具有多种分型，主要有猪链球菌、马链球菌中的类马亚种和兽疫亚种以及传统蓝氏分群法（D、E、L种群）链球菌等三大类[9]。通过血清学分型，按荚膜多糖抗原不同将链球菌分为不同类型，其中2型的致病性最强，病死率最高；目前可采用基因分型，即用多酶切位点电泳等技术进行分型，可表现出不同菌株之间的差异[10]。新疆阿克苏地区某猪场仔猪出现精神沉郁，采食量下降，呼吸困难和抽搐等临床表现，部分仔猪死亡。解剖病死仔猪可见心脏、肝脏和脾脏存在病变，其他脏器无异常，怀疑感染猪链球菌。本试验为确定其病原菌及其耐药性，无菌采集该猪场仔猪病变脏器，进行细菌的分离培养，通过形态学观察、生化试验和16S rRNA序列分析进行鉴定，研究其耐药性，为猪链球菌病的诊断和防治提供参考。1材料与方法1.1样品来源解剖该猪场呼吸困难、抽搐的仔猪，无菌采集其内脏，编号后2 h内冰浴运回实验室，放于-4 ℃保存，用于分菌和进行药敏试验。1.2试剂与仪器试验试剂：胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、细菌微量生化鉴定管、DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司），抗菌药物药敏纸片（杭州微生物公司），绵羊血琼脂平板、Brain Heart Infusion（BHI）培养基（青岛海博生物技术有限公司）等。试验仪器：Gel Doc TM XR+凝胶成像仪（Bio-RAD公司）；TC-5000PCR仪（英国TECHNE公司）、DYY-7C型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）、加热制冷循环器（德国JULABO Laborteckmik G mbh）、HVE-50高压灭菌器（日本HIRAYAMA公司）等。1.3试验方法1.3.1细菌的分离和纯化无菌挑取病死仔猪心脏、肝脏、脾脏病变组织，划线接种于绵羊血琼脂固体培养基上进行病原分离培养，37 ℃培养24~48 h后选取形态不同的单菌落，多次划线接种于BHI固体培养基和绵羊血琼脂固体培养基上进行纯化。选取单一形态的单菌落，接种于BHI液体培养基中增菌，用于保菌和DNA提取。细菌形态学鉴定方法参考《伯杰细菌鉴定手册》[11]。1.3.2分离菌的生化鉴定按说明书将两株分离株分别接种于山梨醇、甘露醇、水杨素、硫化氢、麦芽糖、棉籽糖、木糖、鸟氨酸和七叶苷等细菌生化培养管中，置于37 °C恒温培养箱，24 ｈ后观察生化鉴定结果。1.3.3分离菌的DNA提取及16S rRNA基因扩增按照DNA提取试剂盒说明书操作，提取DNA保存于-20 ℃。对OD260/280检测合格的DNA，参照文献[12]合成细菌16S rRNA基因通用引物（27F:5'－AGAGTTT-GATCATGGCTCAG－3'；1 492Ｒ:5'-TACGGTTACCTT-GTTACGACTT－3'。预期扩增产物长度约为1 400 bp）进行扩增。扩增体系：DNA模板1 μL、EasyTaq SuperMix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 0.5 min，56 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.5 min，35个循环；72 ℃ 10 min，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。1.3.4PCR产物纯化测序按照胶回收试剂盒说明书进行操作，纯化产物保存于-20 ℃。将PCR纯化产物送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。1.3.5分离菌16S rRNA同源性及进化树分析对所测得序列于NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）GenBank数据库中进行比对鉴定，采用软件DNA star对所测的菌株做系统进化树。1.3.6分离菌的药物敏感性试验按照KB纸片法，在MH平板上37 ℃培养24~48 h，测量抑菌圈直径（将纸片直径计算在内），根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）的标准，判断分离菌对17种常用抗菌药物的敏感情况。2结果与分析2.1细菌的分离和纯化（见图1、图2）由图1可知，绵羊血琼脂固体培养基培养24 h，分离菌在培养基上呈圆形、隆起、半透明、光滑且湿润、边缘比较整齐的菌落，且存在β溶血环。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.003.F001图12型猪链球菌血平板溶血Fig.1Hemolysis of Streptococcus suis serotype 2由图2可知，分离菌株经革兰染色镜检呈革兰阳性单个、成对或长短不等链状排列的球菌。综上，初步判断分离株为2型猪链球菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.003.F002图2分离菌革兰染色镜检结果Fig.2Result of Gram staining microscopy2.2分离菌株的生化鉴定结果（见表1）由表1可知，分离菌株可发酵水杨素、麦芽糖、七叶苷，不可发酵山梨醇、甘露醇、硫化氢、棉籽糖、木糖、鸟氨酸，结果符合猪链球菌的生化反应特性，将分离菌株命名为HY-SS2022。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.003.T001表1分离菌株生化鉴定结果Tab.1Results of biochemical identification of isolated strains项目结果项目结果水杨素+硫化氢-麦芽糖+棉籽糖-七叶苷+木糖-山梨醇-鸟氨酸-甘露醇-注：“+”表示阳性“-”表示阴性。2.3分离菌株的16S rRNA扩增结果（见图3）分离菌株DNA经核酸蛋白检测仪检测OD260/280值均在1.8~2.0之间，将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.003.F003图3分离菌株的16S rRNA扩增结果Fig.316S rRNA amplification results of isolated strains注 ： M为DL-2000 Marker；1为阴性对照；2为分离菌株。由图3可知，扩增条带约为1 400 bp，与预计大小相同。2.4分离菌株的16S rRNA系统进化树（见图4）由图4可知，分离菌株HY-SS2022与GenBank中收录的2型猪链球菌同源性最高，均在95％以上，处于同一进化分支。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.003.F004图4系统进化树Fig.4phylogenetic tree结合分离菌的形态特征、生化特性及16S rRNA基因序列比对结果，确定分离菌为2型猪链球菌。2.5分离菌株的药物敏感性试验结果（见表2）由表2可知，分离菌株对头孢哌酮、头孢曲松钠、多西环素、氧氟沙星及环丙沙星表现为敏感；对青霉素、阿米卡星、新霉素表现为中介；对阿莫西林、复方新诺明、氨苄西林、磺胺甲硝唑、四环素、米诺环素、红霉素、庆大霉素、氯霉素和克林霉素表现为不同程度的耐药。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.003.T002表2分离菌株的药物敏感性试验结果Tab.2Results of drug sensitivity tests of isolated strains药物种类药物名称含药量/μg抑菌圈直径/mm敏感程度β-内酰胺类青霉素1013I头孢哌酮1023S阿莫西林3012R头孢曲松钠307S磺胺类复方新诺明198R磺胺甲硝唑3008R四环素类多西环素308S四环素308R米诺环素307R大环内酯类红霉素157R氨基糖苷类庆大霉素1022R阿米卡星3016I新霉素3015I氯霉素类氯霉素3011R林可胺类克林霉素27R喹诺酮类氧氟沙星527S环丙沙星510S注 ：S表示敏感；I表示中介；R表示耐药。3讨论1945年起，全世界范围内开始陆续报道猪链球菌疫情[13]，以仔猪和母猪的患病率最高[14]。我国在1949年，于上海郊区首次发现猪链球菌病，之后国内陆续有报道该病存在[15-18]。1951年，荷兰、英国等国家先后报道了猪链球菌病，其中1、2、7、9型链球菌是致病性最高的病原[19-22]。1963年，猪链球菌病在我国多个省份均有发生；1998年至2020年，我国猪链球菌病发病情况呈现不断上升的趋势，对我国的生猪养殖产业造成了严重的打击，造成了一定经济损失。本试验检出的致病性2型猪链球菌与国内大环境吻合，表明新疆阿克苏地区已出现猪感染2型猪链球菌的情况。猪链球菌对环境耐受极高，四季均可发病，尤其每年的5月至10月传播性最强。猪链球菌病多发生于气候炎热且潮湿的地区，具有地方流行性，潜伏期通常在1周左右[23]。在规模养殖中若因人为或天气原因导致饲养密度大、通风不良、室内空气质量差均可增加感染概率[24]。猪链球菌病通常呈地方性流行，新疫区流行方式一般为暴发性，传播迅速，危害极大；老疫区一般为散发性。本试验中，分离菌株对阿莫西林、复方新诺明、氨苄西林、磺胺甲硝唑、四环素、米诺环素、红霉素、庆大霉素、氯霉素和克林霉素表现为不同程度的耐药，表明该规模化养猪场存在抗生素过度使用的情况，尤其是四环素类抗生素，如多西环素、四环素和米诺环素。建议该场在了解抗生素耐药情况后，合理使用抗生素，如使用头孢哌酮、头孢曲松钠、多西环素、氧氟沙星及环丙沙星等较为敏感的药物进行防治猪链球菌病。4结论本试验从新疆阿克苏地区某规模化猪场病死仔猪体内分离到1株细菌，经细菌分离培养、形态学观察、生化试验和16S rRNA序列鉴定，确定分离菌为2型猪链球菌。药敏试验表明，分离菌具有多重耐药性，对四环素类、磺胺类、大环内酯类、氯霉素类等多种药物表现为耐药；对头孢类药物、诺氟沙星和氨苄西林表现为敏感。本研究结果可为防治该病的临床合理用药提供参考。