禽流感（avian influenza，AI）是高度接触性传染性疾病，传播途径较为广泛，由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起，可感染家禽、野鸟，也可感染哺乳动物甚至人类[1-4]。AIV属于A型流感，根据表面HA和NA抗原性不同，分为若干亚型。目前从禽类已鉴定出15个H亚型，9个NA亚型[5-8]。根据致病性可分为高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza，LPAI）。HPAI造成家禽较高的死亡率，被列为一类传染病。截至目前，HPAI多为H5或H7亚型禽流感病毒感染所致[9-11]。目前白羽肉鸡养殖集约化程度较高，养殖周期短暂，生物安全及饲养管理水平均高于其他种类。蛋鸡和三黄鸡受到成本等因素影响，以家庭养殖场为主，规模为数万只，养殖周期均较长，且生物安全措施低于白羽肉鸡，更易暴露在AI感染中。自2020年12月之后，国内AI疫情频发。作为防控AI最重要的手段，疫苗免疫发挥了重要作用。免疫疫苗之后较短时间内产生抗体，可对机体产生保护。但受临床中环境及生产性能等因素影响，免疫水平与实验室SPF鸡存在较大差异[3]。本试验为研究重组AI疫苗免疫三黄鸡和蛋鸡的效果，监测完全临床养殖中其抗体产生及消长规律，为进一步研究AI疫苗提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1疫苗重组禽流感（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12株、H7N9 Re-3株，批号：21365050），记为疫苗A。市售重组禽流感（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12株、H7N9 Re-3株，批号：2021017），记为疫苗B，由试验养殖场提供。1.1.2检测抗原禽流感（H5N1 Re-11株）检测抗原（批号：2021002）、阳性血清（批号：2021001），禽流感H5N1 Re-12株检测抗原（批号：2021002）、阳性血清（批号：2021001），禽流感H7N9 Re-3株检测抗原（批号：2021004）、阳性血清（批号：2021002），均购自哈尔滨维科生物技术有限公司。1.1.3试验动物14日龄三黄肉鸡40 000只，由广东省江门市某养殖场提供并饲养。14日龄海兰褐蛋鸡20 000只，由辽宁省锦州市某养殖场提供并饲养。1.2试验方法1.2.1试验设计将40 000只三黄肉鸡分为A组、B组、C组，其中A组20 000只，B组19 900只，C组100只。3组分别于不同鸡舍饲养。A组与B组分别免疫疫苗A与疫苗B，C组为不免疫对照组。2周龄首免，颈部皮下注射，0.3 mL/羽份。6周龄进行二免，颈部皮下注射，0.5 mL/羽份[12-13]。20 000只蛋鸡分为D组、E组、F组，D组10 000只，E组9 900只，F组100只。3组于不同鸡舍饲养。D组与E组分别免疫疫苗A与疫苗B，F组为不免疫对照组。2周龄首免颈部皮下注射，0.3 mL/羽份。6周龄进行二免，颈部皮下注射，0.5 mL/羽份。13周龄进行三免，颈部皮下注射，0.5 mL/羽份。1.2.2安全性评价免疫后每天观察试验鸡死亡、精神状态、采食等状况至试验结束[14]。每次免疫后14 d随机抽取10只免疫鸡，观察疫苗注射部位有无硬结、肿胀、溃烂等情况。待120日龄时，每组随机抽取5只鸡，对照组随机抽取5只鸡剖杀，观察疫苗吸收情况。1.2.3抗体监测1.2.3.1采血及血清分离各三黄肉鸡组每组选择15只肉鸡，分别于2（首免前）、4（首免后2 w）、5（首免后3 w）、6（二免前）、8（二免后2 w）、12（二免后6 w）、15（二免后9 w）、17（二免后11 w）周龄采血1.5~2.0 mL，3 000 r/min离心10 min，血清于-20 ℃以下冻存。各蛋鸡组每组选择15只蛋鸡，分别于2（首免前）、4（首免后2 w）、5（首免后3 w）、6（二免前）、8（二免后2 w）、11（二免后5 w）、13（三免前）、15（三免后2 w）、18（三免后5 w）、21（三免后8 w）、24（三免后11 w）周龄采血1.5~2.0 mL，3 000 r/min离心10 min，血清于-20 ℃以下冻存。1.2.3.2HI抗体测定按照《中国兽药典》附录方法进行，分别测定禽流感H5N1 Re-11株、禽流感H5N1 Re-12株、禽流感H7N9 Re-3株等3种抗体水平。1.3数据统计与分析抗体水平数据采用Excel软件进行统计分析，采用graphPad软件作图。结果以平均值表示。2结果与分析2.1安全性评价结果（见表1）由表1可知，免疫后，A组与B组鸡群精神状态、采食、饮水等情况与C组无明显差异；疫苗注射后14 d，随机抽取10只免疫鸡检查注射局部，均无肿胀、溃烂等异常情况发生。免疫后，D组与E组鸡群精神状态、采食、饮水等情况与F组无明显差异；疫苗注射后14 d，随机抽取10只免疫鸡检查注射局部，均无肿胀、溃烂等异常情况发生。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.002.T001表1安全性评价Tab.1Evaluation of safety组别精神及采食局部反应120日龄死淘率/%吸收情况A组精神、采食正常无局部反应0.065/5完全吸收B组精神、采食正常无局部反应0.074/5完全吸收C组精神、采食正常无局部反应——D组精神、采食正常无局部反应0.285/5完全吸收E组精神、采食正常无局部反应0.264/5完全吸收F组精神、采食正常无局部反应——120日龄时，A组死淘12只（死淘率0.06%），B组死淘13只（死淘率0.07%）；各组随机抽取5只鸡剖杀观察疫苗吸收情况，A组疫苗已全部吸收，B组疫苗有1只可见小颗粒。120日龄时，D组死淘28只（死淘率0.28%），E组死淘26只（死淘率0.26%）；各组随机抽取5只鸡剖杀观察疫苗吸收情况，D组疫苗已全部吸收，E组疫苗有1只可见完全吸收的小颗粒。综上所述，市售重组禽流感疫苗安全性评价较好，吸收方面疫苗A略好于疫苗B。2.2抗体监测结果2.2.1三黄鸡免疫后抗体水平消长情况（见表2）由表2可知，首免2周后，机体即可产生抗体，免疫后3周达到高峰值，此时母源抗体下降至2 log2以下，4周后抗体略有下降。二次免疫后抗体迅速上升，HI抗体均达到8.5 log2以上，且维持时间2个月以上（抗体大于8 log2）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.002.T002表2三黄鸡免疫后抗体水平消长情况Tab.2Decline of antibody level in Sanhuang chickens after immunization周龄/wH5/Re-11H5/Re-12H7/Re-3A组B组C组A组B组C组A组B组C组24.404.604.503.403.703.904.404.704.3045.745.121.266.486.541.235.775.231.3357.346.560.566.786.730.217.546.940.3166.786.430.236.065.9506.586.45089.788.7809.459.3609.348.8701210.109.2309.479.45010.569.530159.678.0108.988.6309.588.940178.677.4507.937.5108.948.080log2不同疫苗HI抗体水平比较，使用A疫苗免疫组的三黄鸡H5/Re-11与H7/Re-3抗体水平比B疫苗高0.5~1.0个滴度；使用两种疫苗免疫的鸡H5/Re-12抗体水平相当。结果表明，三黄鸡免疫2种疫苗后3周，3种抗体水平即可达到6 log2以上；二次免疫至出栏时，抗体平均值在8 log2以上，可以产生100%保护。2.2.2蛋鸡免疫后抗体水平消长情况（见表3）由表3可知，首免2周后，机体内HI抗体在5.5 log2以上，3周后达到高峰值（6 log2以上），4周后抗体开始下降。二次免疫2周后，抗体迅速上升，达到9 log2以上，且维持时间5周（7 log2以上）。三免后抗体水平，3种抗体均大于10 log2，维持时间约9周。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.002.T003表3蛋鸡免疫后抗体水平消长情况Tab.3Decline of antibody level in laying hens after immunization周龄/wH5/Re-11H5/Re-12H7/Re-3D组E组F组D组E组F组D组E组F组24.234.163.973.343.513.484.414.344.0646.275.721.066.126.321.356.346.121.5656.846.430.346.456.580.246.896.560.3465.965.6305.875.9206.015.78088.757.8308.928.7408.898.360118.847.6309.018.9208.677.730138.067.5608.238.2607.847.2801510.9310.56010.6710.45010.7810.560189.879.0709.9610.01010.159.890218.877.8909.018.9409.789.350247.276.8307.767.4208.057.630log2与三黄肉鸡类似，使用A疫苗免疫组的蛋鸡H5/Re-11与H7/Re-3抗体水平比B疫苗高0.3~1.0个滴度；使用两种疫苗免疫的鸡H5/Re-12抗体水平相当，疫苗A略好于疫苗B。结果表明，蛋鸡首次免疫后3周，H5/Re-11、H5/Re-12、H7/Re-3等3种抗体即可达到6 log2以上，免疫3次后到产蛋高峰之前（150日龄），HI抗体大于8 log2，可以产生100%保护。综上所述，对于养殖周期较长的蛋鸡和三黄鸡，免疫两次商品化禽流感三价灭活疫苗后，HI抗体均达到9 log2以上，且维持至120 d以上，可到达保护水平。2~3次免疫后基本无残留。不同厂家疫苗抗体水平有所差异。3讨论禽流感是严重危害我国养鸡业的疫病之一，禽流感疫苗在该病的防控中发挥了不可替代的作用。免疫后抗体水平是评价免疫是否成功的主要指标，但受到养殖场环境、母源抗体、疫苗质量等因素影响，商品鸡与SPF鸡免疫禽流感疫苗后，抗体水平差别较大。为了解禽流感疫苗在临床中的使用情况，本研究分别使用不同厂家的免疫禽流感疫苗对三黄肉鸡与商品蛋鸡进行免疫，并评价了其安全和效力。试验结果显示，首次免疫后，三黄肉鸡H5/Re-11抗体达到5.0 log2以上，H5/Re-12抗体约6.0 log2，H7/Re-3抗体可达到5.5 log2以上，4周后开始下降。二次免疫后抗体水平上升约3个滴度，持续期可达近2个月。结果表明，免疫商品禽流感三价灭活疫苗可以对鸡群产生较高水平的保护，不同厂家疫苗效果略有不同，使用A疫苗免疫的鸡群H5/Re-11与H7/Re-3抗体水平比B疫苗高0.5~1.0个滴度。三黄肉鸡养殖周期约3~4个月，进行2次免疫，抗体可以达到保护水平（HI6 log2）。商品蛋鸡监测结果与三黄肉鸡类似，使用A疫苗免疫的鸡群H5/Re-11与H7/Re-3抗体水平比B疫苗提高了0.3~1.0个滴度。商品蛋鸡开产前一般免疫3~4次，本试验分别于2、6、13周龄进行3次免疫，使开产至高峰前产蛋维持在7~9 log2之间，产蛋上升期间，抗体水平下降较快，建议高峰前进行1次免疫。通过上述试验可知，目前商品禽流感三价灭活疫苗免疫蛋鸡和肉鸡后，可以产生较高HI抗体水平，且维持时间较长，在一定意义上防控了高致病性禽流感在家禽中的传播。近年来家禽发生高致病性禽流感的报道较少，与家禽免疫禽流感疫苗的研发与使用具有很大关联，应进一步加强相关免疫政策执行力度或落实相关免疫政策。4结论本研究结果表明，三黄肉鸡经过两次免疫禽流感，抗体达到6 log2以上，可以保护机体不受感染。商品蛋鸡开产前三次免疫后，开产前至产蛋高峰维持在7~9 Log2，但下降较快。综上所述，肉鸡出栏前（120 d）免疫禽流感疫苗2次，蛋鸡开产前免疫3次，可防护禽流感的感染。