近年来，我国水产养殖行业迅猛发展，对虾养殖密度逐渐上升，养殖环境持续恶化，导致南美白对虾的病毒感染疾病日益严重[1]，易发生应激导致大面积死亡。南美白对虾在育成期对致病因素和环境变化的抵抗能力较弱，过度使用消毒剂或抗生素会对对虾养殖业产生不利影响。辣蓼含有黄酮及萜类等多种化学活性成分，如黄酮类、挥发油、糅质类、脂肪酸、三萜类、蒽醌、糖苷和蓼酸等。研究表明，辣蓼主要成分黄酮具有生物抗氧化性、清除自由基、杀虫、抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌和抗肿瘤、镇痛止血等多种生物活性[2]以及抗病毒[3]、提高免疫力[3]等作用。因此，将其作为免疫调节剂研发应用于南美白对虾养殖过程，对南美白对虾健康生态养殖的发展具有重要意义。本课题组前期研究结果表明[4]，辣蓼黄酮提取物能够提高南美白对虾血淋巴细胞的细胞活性，并通过升高细胞内免疫相关酶活性。依据《兽药研究技术指导原则汇编（2006—2011）》兽用中药、天然药物安全药理学研究技术指导原则[5]，本试验通过连续给药后测定南美白对虾体指数、血淋巴生化指标，观察肝胰腺的组织病理学变化等进一步研究辣蓼黄酮提取物对南美白对虾生长性能的影响，确定其安全性及临床用药的安全剂量，明确药物的安全范围，为进一步的临床应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验药品辣蓼黄酮提取物由广西大学动物科学技术学院兽医药理学实验室研制并建立药物质量标准，由广西普大动物保健品有限公司GMP车间生产形成中试产品（批号：20200516，规格：50 g/包）。1.1.2试验动物SPF级南美白对虾600尾，体长3.5~5.0 cm，体重4.0~6.0 g，临床健康，由广西水产科学研究院SPF级南美白对虾基地提供。临床检测南美白对虾主要病原微生物均为阴性，对虾采食正常，充满活力，虾群洄游好。试验对虾饲养于盐度为（5±1）‰的稀释海水中，水温（28±2） ℃的500 L白色塑料桶内，适应性饲养14 d。1.1.3仪器与试剂主要仪器：UVmini-1240紫外可见光光度计（岛津公司）、TECAN多功能酶标仪（帝肯公司）、全自动脱水机（亚光医用电子技术有限公司）、半自动切片机（徕卡显微系统贸易有限公司）。主要试剂：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、总蛋白（TP）、尿素氮（BUN）等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。1.2试验方法1.2.1含药饵料制备将南美白对虾专用饵料（批号：20200826，广西海大饲料有限公司）粉碎后加入不同剂量的辣蓼黄酮提取物和含10%饲料黏合剂（批号：GB12309-90，百洋产业投资集团股份有限公司），加入适量去离子水，充分搅拌糅合至团状饲料团不掉渣后放入饲料颗粒机，调整出料细度及长短至符合专用饵料要求，缓缓压出，均匀散开并置于40 ℃恒温干燥箱连续烘干8 h以上，烘干后分装于真空包装袋内。1.2.2试验设计（见表1）将适应性饲养14 d的南美白对虾600尾，随机分为对照组以及1、3、5、10倍剂量组，每组3个重复，每个重复40尾虾，分别饲养于300 L的塑料桶中。每天按南美白对虾体重的4%投料量分4次定时进行投喂，连续饲喂35 d。试验期间24 h不间断供气，每天换水1/3，以确保水质水温不发生明显变化。每天观察并详细记录各组试验虾的活动、进食情况及其他异常情况。若试验期间发现有虾死亡，则应记录死亡时间、数量、临床症状并进行病理剖检。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.010.T001表1试验设计Tab.1Experiment design组别数量/尾处理对照组120不用药1倍剂量组120每天定时投喂4次，4.0 g/kg饵料连用35 d3倍剂量组120每天定时投喂4次，12.0 g/kg饵料连用35 d5倍剂量组120每天定时投喂4次，20.0 g/kg饵料连用35 d10倍剂量组120每天定时投喂4次，40.0 g/kg饵料连用35 d1.2.3测定指标及方法1.2.3.1体重、体长给药1 d及给药后第17、35 d，每组随机抽取30尾虾称量体重、体长，计算增重率。增重率（WGR）=（Wt-W0）/W0×100%（1）式中：W0为试验虾初重（g）；Wt为试验虾末重（g）。1.2.3.2血液生化指标检测给药第17、35 d，对各试验组抽取的南美白对虾进行采血，用含0.1 mL柠檬酸钠抗凝剂的1 mL一次性无菌注射器于虾第二腹节采集血淋巴，用于血液生理生化指标检测。根据试剂盒操作说明测定血淋巴中的ALT、AST、TP、BUN及TG含量。1.2.3.3血细胞分类计数将采集的血淋巴滴在洁净病理级显微镜载玻片上，缓缓推平，待其晾干后用甲醇固定。进行吉姆萨染色后置于光学显微镜下观察计数，统计每100个血细胞中颗粒细胞、半颗粒细胞和透明细胞的分类计数。1.2.3.4病理组织学检查各试验组南美白对虾采血后，完整采摘肝胰腺组织置于10%福尔马林溶液固定，脱水、包埋、切片、H.E.染色，置于显微镜下观察脏器组织的病理组织学变化。1.3数据统计与分析试验数据采用IBM SPSS Statistics 23.0生物统计软件进行单因素方差分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1临床观察结果试验期间，各组南美白对虾的体表颜色呈淡青色、活力良好、采食正常、排泄物形状良好，未见其他异常表现。2.2辣蓼黄酮提取物对南美白对虾体重、体长及增重率的影响（见表2）由表2可知，连续给药17 d时，与对照组相比，1倍剂量组和3倍剂量组对虾的体长、体重和增重率均有所升高，且3倍剂量组的增重率显著升高（P0.05）。给药第35 d时，与对照组相比，1倍剂量组、3倍剂量组和5倍剂量组对虾的体长、体重和增重率均极显著升高（P0.01）。结果表明，长期饲喂辣蓼黄酮提取物可有效促进对虾肠道吸收，提高饲料利用率。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.010.T002表2辣蓼黄酮提取物对南美白对虾体重、体长及增重率的影响Tab.2Effects of lavonoid extract of Polygonum hydropiper L. on body weight, body length and weight gain rate of Penaeus vannamei试验期组别初始体长/cm终末体长/cm初重/g末重/g增重率/%给药第17 d对照组4.75±0.255.77±0.181.60±0.342.86±0.270.74±0.161倍剂量组5.03±0.155.93±0.211.39±0.113.14±0.380.90±0.233倍剂量组5.17±0.215.85±0.291.79±0.153.21±0.490.95±0.30*5倍剂量组4.80±0.135.61±0.321.68±0.222.90±0.360.76±0.2210倍剂量组5.03±0.065.40±0.35**1.79±0.042.74±0.410.66±0.25给药第35 d对照组4.75±0.256.82±0.441.60±0.344.94±0.721.99±0.431倍剂量组5.03±0.157.36±0.31**1.39±0.115.91±0.65**2.58±0.39**3倍剂量组5.17±0.217.42±0.30**1.79±0.156.41±0.80**2.89±0.48**5倍剂量组4.80±0.137.25±0.34**1.68±0.225.97±0.67**2.62±0.41**10倍剂量组5.03±0.066.80±0.241.79±0.044.85±0.461.94±0.28注 ：与空白对照组相比，*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）；下表同。2.3辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血液生化指标的影响（见表3）由表3可知，连续给药17 d时，与对照组相比，3倍剂量组、5倍剂量组和10倍剂量组对虾血液AST活性显著升高（P0.05），5倍剂量组对虾BUN含量显著升高（P0.05），10倍剂量组对虾BUN含量极显著升高（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.010.T003表3辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血液生化指标的影响Tab.3Effects of lavonoid extract of Polygonum hydropiper L. on blood biochemical indices of Penaeus vannamei试验期组别TP/(mg/L)TG/(mmol/L)ALT/(U/L)AST/(U/L)BUN/（mmol/L）给药第17 d对照组3 435.84±391.960.26±0.1088.81±12.3014.46±2.161.96±1.051倍剂量组2 236.95±340.01**0.28±0.1783.37±15.7716.81±3.451.62±1.113倍剂量组3 574.74±287.930.40±0.21*72.37±12.5223.49±1.03*2.18±0.935倍剂量组2 609.35±367.29*0.32±0.2772.69±16.1322.57±2.39*4.67±1.71*10倍剂量组3 667.43±309.450.32±0.1263.73±13.99*22.47±3.18*5.44±1.30**给药第35 d对照组5 452.79±249.550.25±0.1197.64±10.6122.58±7.390.56±0.111倍剂量组5 266.05±297.310.36±0.1180.87±8.3442.56±12.90**0.72±0.18*3倍剂量组5 380.02±189.240.34±0.18116.04±13.9046.62±22.71**0.45±0.115倍剂量组6 208.90±216.060.70±0.15**84.04±11.7044.08±14.26**0.51±0.0910倍剂量组5 567.02±168.310.35±0.15115.87±16.1231.21±8.140.49±0.12给药第35 d时，与对照组相比，5倍剂量试验组对虾血液TG含量均极显著升高（P0.01），3倍剂量组、5倍剂量组和10倍剂量组对虾血液AST活性极显著升高（P0.01），1倍剂量组对虾血液BUN含量显著升高（P0.05），其他各剂量试验组的各项指标差异均不显著（P0.05）。结果表明，辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血液生化指标无明显影响。2.4辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血细胞分类计数结果的影响（见表4）由表4可知，连续给药第17 d，1倍剂量组、3倍剂量组和10倍剂量组对虾血液中颗粒细胞数均高于对照组，但差异不显著（P0.05）；5倍剂量组对虾血液中颗粒细胞数显著低于对照组（P0.05）；各组血液半颗粒细胞数和透明细胞数差异不显著（P0.05）。给药第35 d，3倍剂量组、5倍剂量组和10倍剂量组对虾血液中颗粒细胞数、半颗粒细胞数及透明细胞数均高于对照组，但差异不显著（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.010.T004表4辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血细胞分类计数结果的影响Tab.4Effects of lavonoid extract of Polygonum hydropiper L. on blood cell classification and counting results of Penaeus vannamei试验期组别颗粒细胞半颗粒细胞透明细胞给药第17 d对照组55.00±4.8634.67±1.5316.33±1.421倍剂量组58.33±2.8934.00±2.1313.33±3.213倍剂量组61.67±2.8928.00±1.8414.00±2.115倍剂量组45.00±4.82*35.00±2.4317.67±1.0810倍剂量组60.00±5.1632.67±2.0814.67±2.23给药第35 d对照组61.67±7.6426.33±1.5312.33±1.481倍剂量组54.33±6.0325.67±4.7311.67±3.793倍剂量组52.33±6.5132.33±3.0614.67±1.535倍剂量组54.67±3.5128.67±2.0814.00±1.2110倍剂量组44.33±4.1629.33±1.5313.33±3.21结果表明，辣蓼黄酮提取物10倍剂量范围内对南美白对虾血细胞分类计数影响不大，且一定剂量的辣蓼黄酮提取物能够升高血细胞中颗粒细胞分类数量，从而提高机体的免疫功能。2.5南美白对虾肝胰腺组织病理学检查结果（见图1）由图1可知，辣蓼黄酮提取物连续饲喂35 d，各试验组和对照组南美白对虾的肝胰腺组织结构清晰，肝小管轮廓清晰，细胞核质分明，细胞排列整齐，未见明显病理变化。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.010.F001图1南美白对虾肝胰腺组织病理学检查结果Fig.1Histopathological results of hepatopancreas of Penaeus vannamei结果表明，辣蓼黄酮提取物对南美白对虾的肝胰腺组织无明显影响，具有良好安全性。3讨论增重率及体长体重变化是评价药物或饲料影响靶动物生长性能最直观的指标，药物或饲料的适口性及其对肠道健康的影响均可通过增重率判断[6]。黄酮类化合物具有抗氧化作用[7]，并能够改善动物肠道菌群[8]，从而提高其生长性能。王咏梅等[9]研究发现，在饵料中添加50 mg/kg桑叶黄酮能够提高南美白对虾的增重率。林厦菁等[10]研究发现，在仔猪饲料中添加40 mg/kg的大豆异黄酮能够降低仔猪的料重比，提高仔猪日增重。在本研究中，饲喂含辣蓼黄酮提取物饵料至第17 d和35 d时，1倍剂量组、3倍剂量组、5倍剂量组南美白对虾的体长、增重和增重率均有所提高，表明一定剂量范围内辣蓼黄酮提取物能够促进南美白对虾的生长。给药第17 d时，10倍剂量组对虾的体重极显著低于对照组，可能与药物剂量、饲料适口性等有关。血液生化指标可反映动物机体的健康状态。而AST[11]广泛存在于心脏、肝脏、肾脏、脑、骨骼肌等组织，当这些组织发生病变时，AST从组织细胞内逸出，随即进入血液，使血液中AST活性增高[12-14]；肝脏、心肌等组织细胞损伤时，ALT[11]也释放入血液。因此，在临床上通过测定血液中ALT的活性可判定脏器病变的性质和程度[15-18]。在本研究中，给药第35 d时，与对照组相比，除了5倍剂量试验组对虾血液中TG含量有所升高，其他各剂量试验组的各项指标均无显著变化；但在给药第17 d时，辣蓼黄酮提取物3倍剂量组、5倍剂量组、10倍剂量组对虾血液中ALT活性显著高于对照组，其他指标均无显著差异，分析其原因可能是较高剂量的辣蓼黄酮提取物对南美白对虾具有一过性的肝毒性作用。TG[18-20]由一分子甘油和三分子脂肪酸脱水酯化而成，高TG提示泌尿系统疾病发生[21]。BUN是机体蛋白质代谢的终末产物，当泌尿系统发生疾患时，血液中BUN含量会升高[22]。在本研究中，饲喂辣蓼黄酮提取物至第17 d时，3倍剂量组对虾血液TG含量和5倍剂量组对虾血液BUN含量均显著高于对照组，10倍剂量组BUN含量极显著高于对照组；第35 d时，5倍剂量组对虾血液TG含量极显著高于对照组，其他各剂量试验组对虾血液BUN含量与对照组相比差异不显著。分析其原因可能是一定剂量辣蓼黄酮提取物在短时间内刺激对虾肝胰腺功能，从而出现类似肾损伤相关指标升高。但综合其他各项指标，辣蓼黄酮提取物南美白对虾肝胰腺功能并无明显损伤和影响。目前普遍将南美白对虾血淋巴细胞分为颗粒细胞、半颗粒细胞及透明细胞[23]，这3类细胞主要功能是负责对虾机体的防御反应，并具有吞噬作用。在正常生理条件下，3种细胞的比例相对恒定，若发生疾病或应激时，其数量和比例会发生改变[24]。在血细胞数量增加到一定程度时可提高机体的防御能力，增强免疫功能[25]。隋大鹏[26]研究发现，定期投喂微生态制剂可使对南美白对虾颗粒细胞、半颗粒细胞比例明显增高，血细胞总数明显增加。本研究中，给药第17 d时，辣蓼黄酮提取物的1倍剂量组、3倍剂量组和10倍剂量试验组对虾血液中颗粒细胞数高于对照组，但差异不显著，表明一定剂量的辣蓼黄酮提取物在一定程度上能够提高对虾免疫功能。第35 d时，3倍剂量组、5倍剂量组和10倍剂量组对虾血液中颗粒细胞数、半颗粒细胞数及透明细胞数高于对照组，但差异不显著。结果表明，辣蓼黄酮提取物可通过升高南美白对虾的血细胞数量和比例增强机体的免疫功能。病理组织学变化能够直观反映脏器的损伤程度，是评价药物毒副作用的重要指标。肝胰腺是南美白对虾的主要器官[27]，具有消化、免疫及造血功能。南美白对虾的肝胰腺为复管状结构，由多级分支小管组成，管腔呈五角或四角星形状。本试验中，给药17 d和35 d时，各组南美白对虾肝胰腺组织结构完整，肝小管轮廓清晰，管腔呈五角星形状，未见异常病理变化。结果表明，10倍剂量范围内的辣蓼黄酮提取物并未引起南美白对虾肝胰腺组织的损伤，对主要脏器无毒副作用。4结论本研究结果表明，辣蓼黄酮提取物在临床推荐剂量的1、3、5倍范围内连续给予靶动物（南美白对虾）饲喂35 d安全，无明显毒副作用，并且能够有效地提高南美白对虾的体长、体重及增重率，具有促进南美白对虾生长发育的作用。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.02.010.F002